9-ACTUALIZACIÓN NORMATIVA DENOMINACIONES DE ORIGEN PRODUCTOS LÁCTEOS EN ESPAÑA

A continuación, se incluye la relación de las principales disposiciones establecidas en la normativa española, que regulan la calidad alimentaria, y son directamente aplicables a las denominaciones de origen de los productos lácteos (quesos y mantequilla).

Normativa aplicable a quesos con denominación de origen (DOP):
1.- ORDEN DE 24 DE JUNIO DE 1985 (BOE de 5 de julio), por la que se ratifica el Reglamento de la Denominación de Origen “Mahón” y de su Consejo Regulador.
Modificado -se da nueva redacción a los artículos 5.1, 10, 13, 15, 16, 35, 36 y 42, en sus apartados 1, 3, 4 y 5 y al artículo 48- por:
Orden de 24 de noviembre de 1993 (BOE de 3 de diciembre).
2.- ORDEN DE 29 DE OCTUBRE DE 1985 (BOE de 13 de noviembre), por la que se ratifica el Reglamento de la Denominación de Origen “Queso de Cantabria” y de su Consejo Regulador.
Corrección de errores en BOE de 10 de diciembre de 1985.
Modificado -el nombre de la Denominación de Origen Protegida “Queso de Cantabria” pasa a ser “Queso Nata de Cantabria”- por:
Orden APA/398/2007, de 13 de febrero (BOE del 26).
3.- ORDEN DE 29 DE JUNIO DE 1990 (BOE de 12 de julio), por la que se ratifica el Reglamento de la Denominación de Origen “Cabrales” y de su Consejo Regulador.
Corrección de errores en BOE de 31 de julio de 1990.
4.- ORDEN DE 11 DE MARZO DE 1991 (BOE del 14) por la que se ratifica el Reglamento de la Denominación de Origen ”Roncal” y de su Consejo Regulador.
Modificado -artículos 5.1, 6.b, 10.1, 16.1, 31.1 y 41.1- por:
Orden de 3 de octubre de 2001 (BOE del 18).
Se concede la protección nacional transitoria a la denominación de origen protegida "Roncal", por:
Resolución de 16 de febrero de 2009 (BOE de 21 de marzo).
Se deja sin efecto la Resolución de 16 de febrero de 2009, por:
Resolución de 27 de noviembre de 2014 (BOE de 22 de diciembre).
5.- ORDEN DE 14 DE ABRIL DE 1993 (BOE del 27), por la que se ratifica el Reglamento de la Denominación de Origen “Queso de La Serena” y de su Consejo Regulador.
Corrección de errores en BOE de 17 de mayo de 1993.
6.- ORDEN DE 6 DE MAYO DE 1993 (BOE del 20), por la que se aprueba el Reglamento de la Denominación de Origen “Queso Zamorano” y de su Consejo Regulador.
Corrección de errores en BOE de 25 de junio de 1993. Se concede la protección nacional transitoria a la modificación de la Denominación de Origen Protegida «Queso Zamorano», por:
Resolución de la Dirección General del Instituto Tecnológico Agrario de Castilla y León (BOE de 5 de febrero de 2013).
7.- ORDEN DE 24 DE NOVIEMBRE DE 1993 (BOE de 25 de diciembre), por la que se ratifica el Reglamento de la Denominación de Origen “Queso Tetilla” y de su Consejo Regulador.
8.- ORDEN DE 30 DE NOVIEMBRE DE 1993 (BOE de 3 de diciembre), por la que se aprueba el Reglamento de la Denominación de Origen “Idiázabal” y de su Consejo Regulador.
Modificada –artículo 12.2- por:
Orden de 23 de marzo de 1999 (BOE de 9 de abril).
Modificada -artículos 3, 13, 24, 27, 35, 44 y 45 y se añaden los artículos 14 bis, 16 bis y 46- por:
Orden APA/1855/2002, de 4 de julio (BOE del 19).
Modificada -artículo 14- por:
Orden APA/2943/2007, de 27 de septiembre (BOE de 10 de octubre).
9.- ORDEN DE 1 DE MARZO DE 1994 (BOE del 8), por la que se ratifica el Reglamento de la Denominación de Origen “Picón Bejes-Tresviso” y de su Consejo Regulador.
10.- ORDEN DE 7 DE MARZO DE 1994 (BOE del 21), por la que se ratifica el Reglamento de la Denominación de Origen “Quesucos de Liébana” y de su Consejo Regulador.
11.- ORDEN DE 23 DE NOVIEMBRE DE 1995 (BOE de 11 de diciembre), por la que se ratifica el Reglamento de la Denominación de Origen “Queso Manchego” y de su Consejo Regulador.
Se publica el pliego de condiciones de la Denominación de Origen Protegida, por:
Orden APA/3273/2007, de 25 de octubre (BOE de 13 de noviembre).
Se concede la protección nacional transitoria a la modificación de la DOP, por:
Resolución de 27 de enero de 2011 (BOE de 17 de febrero).
12.- ORDEN DE 6 DE SEPTIEMBRE DE 1996 (BOE del 14), por la que se ratifica el Reglamento de la Denominación de Origen Queso Majorero y de su Consejo Regulador.
13.- ORDEN DE 26 DE DICIEMBRE DE 1997 (Diario Oficial de Galicia de 9 de enero de 1998, pag.190) por la que se aprueba el Reglamento de la denominación de origen Arzúa-Ulloa y de su consejo regulador.
Inscrito en el Registro de Denominaciones de Origen Protegidas y de Indicaciones Geográficas Protegidas (CE) mediante el Reglamento (UE) 20/2010, de 12 de enero (DOUE L 8, de 13 de enero).
14.- ORDEN DE 3 DE JULIO DE 1998 (Diario Oficial de Castilla y León del 9) por la que se aprueba el Reglamento de la Denominación de Origen “Queso de Valdeón” y de su Consejo Regulador.
Inscrito en el Registro de Denominaciones de Origen Protegidas y de Indicaciones Geográficas Protegidas (CE) mediante el Reglamento (CE) 135/2004, de 27 de enero (DOUE L 21, de 28 de enero).
15.- ORDEN DE 3 DE AGOSTO DE 1998 (Diario Oficial de la Generalidad de Cataluña de 9 de septiembre), por la que se crea la Denominación de Origen Protegida “Queso de l´Alt Urgell y La Cerdanya”.
Modificada – artículo 1 y sustituye el texto del Reglamento- por:
Orden de 28 de marzo de 2000 (Diario Oficial de la Generalidad de Cataluña de 7 de abril). Corrección de errores en DOGC de 23 de octubre de 2000.
Inscrito en el Registro de Denominaciones de Origen Protegidas y de Indicaciones Geográficas Protegidas (CE) mediante el Reglamento (CE) 2446/2000, de 6 de noviembre (DOCE L 281, de 7 de noviembre).
16.- ORDEN DE 31 DE AGOSTO DE 2001 (BOE de 11 de septiembre), por la que se ratifica el Reglamento de la Denominación de Origen “Queso Palmero” y de su Consejo Regulador.
17.- ORDEN DE 10 DE OCTUBRE DE 2001 (BOE del 25), por la que se ratifica el Reglamento de las Denominaciones de Origen “Queso de Murcia” y “Queso de Murcia al Vino” y de su Consejo Regulador.
18.- ORDEN APA/1144/2002, de 6 de mayo (BOE del 23), por la que se ratifica el Reglamento de la Denominación de Origen “Torta del Casar”.
Modificada -se corrige el artículo 5- por:
Orden APA/2708/2005, de 8 de agosto (BOE del 19).
19.- DECRETO 69/2003, de 20 de mayo (Diario Oficial de Extremadura del 27), por el que se aprueba el Reglamento de la Denominación de Origen Protegida “Queso de Ibores” y su Consejo Regulador.
Corrección de errores en Diario Oficial de Extremadura de 2 de agosto de 2003.
Modificado –artículos 36, 37 y 38- por:
Decreto 35/2004, de 5 de abril (Diario Oficial de Extremadura del 13).
Inscrito en el Registro de Denominaciones de Origen Protegidas y de Indicaciones Geográficas Protegidas (CE) mediante el Reglamento (CE) 205/2005, de 4 de febrero (DOUE L 33, de 5 de febrero).
20.- RESOLUCION DE 6 DE AGOSTO DE 2003 (Boletín Oficial del Principado de Asturias del 22), de la Consejería de Medio Rural y Pesca, por la que se aprueba, con el carácter transitorio establecido en el reglamento (CEE) 2081/92, el Reglamento de la Denominación de Origen Protegida "Gamoneu" o "Gamonedo".
Inscrito en el Registro de Denominaciones de Origen Protegidas y de Indicaciones Geográficas Protegidas (CE) mediante el Reglamento (CE) 676/2008, de 16 de julio (DOUE L 33, de 17 de julio).
21.- ORDEN APA/1893/2004, de 7 de junio (BOE del 18), por la que se ratifica el Reglamento de la Denominación de Origen Protegida “Afuega’l Pitu”.
22.- ORDEN APA/1540/2005, de 17 de mayo (BOE del 30), por la que se ratifica el reglamento de la denominación de origen protegida “San Simón da Costa” y de su Consejo Regulador.
23.- ORDEN APA/1559/2005, de 17 de mayo (BOE del 31), por la que se ratifica el reglamento de la denominación de origen protegida “Cebreiro” y de su Consejo Regulador.
24.- RESOLUCIÓN DE 15 DE ABRIL DE 2008 (BOE de 6 de junio), de la Dirección General de Industria Agroalimentaria y Alimentación, por la que se concede la protección nacional transitoria a la denominación de origen protegida «Queso Flor de Guía y Queso de Guía».
25.- RESOLUCIÓN DE 16 DE FEBRERO DE 2009 (BOE de 21 de marzo), de la Dirección General de Industria y Mercados Alimentarios, por la que se concede la protección nacional transitoria a la denominación de origen protegida "Queso Casín".
26.- RESOLUCIÓN DE 18 DE MAYO DE 2009 (BOE de 6 de julio), de la Dirección General de Industria y Mercados Alimentarios, por la que se concede la protección nacional transitoria a la Denominación de Origen Protegida Queso Camerano.
27.- REGLAMENTO DE EJECUCIÓN (UE) 1110/2013 de la Comisión, de 5 de noviembre de 2013 (DOUE L 298, de 8.11.2013), por el que se inscribe una denominación en el Registro de Denominaciones de Origen Protegidas y de Indicaciones Geográficas Protegidas [Queso Los Beyos (IGP)].
La Información 2013/C 60/06 contiene la publicación del correspondiente pliego de condiciones (DOCE C 60, de 1 de marzo de 2013).


Normativa aplicable a mantequillas con denominación de origen (DOP):
1.- ORDEN DE 14 DE DICIEMBRE DE 2001 (BOE de 5 de enero de 2002) por la que se ratifica el Reglamento de la Denominación de Origen Protegida “Mantequilla de l’Alt Urgell y la Cerdanya”.
2.- ORDEN APA/3346/2004, de 29 de septiembre (BOE de 15 octubre), por la que se ratifica el Reglamento de la Denominación de Origen Protegida “Mantequilla de Soria”.Se aprueba una modificación que no es de menor importancia del pliego de condiciones por.
Reglamento de Ejecución (UE) 1190/2014, de 24 de octubre de 2014 (DOUE L 318, de 5.11.2014).
La Información 2014/C188/07 contiene la publicación de la solicitud de modificación del correspondiente pliego de condiciones (DOUE C 188, de 20 de junio de 2014).



Más información: Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente. Gobierno de España. Web oficial Magrama (22/12/2014)

Fuente: Circular informativa (2015). Asociación de Queseros Artesanos de Andalucía (AQAA). María Jesús Jiménez Horwitz (presidenta). Sede AQAA: Jayena (Granada, España).
José Luis Ares Cea (asesor científico)

8-ACTUALIZACIÓN NORMATIVA MANTEQUILLA EN ESPAÑA

A continuación, se incluye la relación de las principales disposiciones establecidas en la normativa española, que regulan la calidad alimentaria, y son directamente aplicables a la mantequilla.

Disposiciones estatales:

REAL DECRETO 200/2009, de 23 de febrero (BOE de 5 de marzo), por el que se derogan determinadas disposiciones que inciden en las normas de calidad para la mantequilla destinada al mercado nacional.

Nota: Se mantiene la referencia al Real Decreto 145/1997, derogado y sustituido por el Real Decreto 142/2002, por constar en él la derogación expresa de las listas positivas de aditivos distintos de los colorantes y edulcorantes autorizados en las normas específicas.



Más información: Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente. Gobierno de España. Web oficial Magrama (22/12/2014)

Fuente: Circular informativa (2015). Asociación de Queseros Artesanos de Andalucía (AQAA). María Jesús Jiménez Horwitz (presidenta). Sede AQAA: Jayena (Granada, España).
José Luis Ares Cea (asesor científico)

MANTEQUILLA: EQUIVALENCIAS MÉTODOS DE ANÁLISIS EN ESPAÑA

A continuación, se relacionan las equivalencias de las principales normas analíticas aplicadas en España para la toma de muestras y análisis de la mantequilla, según los organismos de procedencia, indicando en cada caso el código de identificación de las mismas.

UNE 34701.h1-Análisis de mantequilla.
UNE 34702.h1-Métodos de ensayo de la mantequilla. Extracción de muestras.
AF V04-311-Toma de muestras de mantequilla para el análisis físico-químico.
FIL 6A: 1969-Determinación del índice de acidez de la materia grasa de la mantequilla (método de referencia).
FIL 7A: 1969-Determinación del índice de refracción de la materia grasa de la mantequilla (método de referencia).
FIL 8: 1959-Determinación del índice de yodo de la materia grasa de la mantequilla (método de Wijs).
FIL 10: 1960-Determinación del contenido de agua de la mantequilla.
FIL 11: 1960-Determinación del contenido en sólidos magros de la mantequilla.
FIL 12A: 1969-Determinación en sal (cloruro sódico) de la mantequilla (método de referencia).
FIL 23: 1964-Determinación del contenido en agua del aceite de mantequilla (método de Karl Fischer).
FIL 24: 1964-Determinación del contenido en materia grasa del aceite de mantequilla.
FIL 80: 1977-Determinación de agua, sólidos magros y grasa en la misma muestra de mantequilla.
FIL 104: 1981-Determinación del pH del suero (método potenciométrico).
ISO 1193-1973-Sondas para la mantequilla.
ISO/R 1738-1971-Determinación del contenido en sal de la mantequilla (método de referencia).
ISO 1739-1975-Determinación del índice de refracción de la grasa en la mantequilla.
ISO/R 1740-1971-Determinación del índice de acidez de la materia grasa en la mantequilla (método de referencia).
ISO 3727-1977-Determinación del contenido en agua, materia seca no grasa y materia grasa sobre la misma muestra de mantequilla (método de referencia).
ISO 1738-1980-Determinación del contenido en sal en la mantequilla (método de referencia).
ISO 1740-1980-Determinación del índice de acidez de la grasa en la mantequilla (método de referencia).
AF V04-315-Análisis de los ácidos grasos por cromatografía en fase gaseosa en mantequilla y materias grasas butíricas de acidez débil.

Las normas denominadas UNE (Una Norma Española) son publicadas por el Instituto Nacional de Racionalización y Normalización (IRANOR), el cual es miembro de la Organización Internacional de Normalización (ISO), que también publica sus propias normas, las ISO, en idioma inglés. La Federación Internacional de Lechería (FIL/IDF) publica las normas FIL en idiomas inglés y francés.

Las normas UNE, ISO y AFNOR, así como otras normas nacionales o internacionales pueden obtenerse a través del IRANOR (Madrid, España). Las Normas FIL pueden obtenerse a través del Comité Nacional Lechero o en la Federation Internationale de Laiterie (Bruxelles, Bélgica).

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: AGUA, GRASA Y EXTRACTO SECO MAGRO EN MANTEQUILLA-1

Continuando con las técnicas de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación del extracto seco magro y del contenido de agua y grasa en la mantequilla.

Principios y fundamentos metodológicos. 

Se define el contenido de agua en la mantequilla como la pérdida de masa, expresado como porcentaje (en masa), según se determina por el procedimiento descrito.

Se define el contenido de extracto seco magro en la mantequilla como el porcentaje (en masa), de las sustancias, según se determina.

Se define el contenido en materia grasa en la mantequilla como el porcentaje, en masa, que se obtiene restando de 100 el contenido de agua y el de extracto seco magro.

El contenido de agua se determina gravimétricamente secando una cantidad conocida de mantequilla a 102 ± 2 ºC.

El contenido de extracto seco magro se determina gravimétricamente después de extraer con éter de petróleo la grasa de la mantequilla secada.

Material y aparatos utilizados.

-Balanza analítica con una tolerancia de 0,1 mg.

-Estufa de desecación bien ventilada y controlada mediante termostato, ajustada para su funcionamiento a una temperatura de 102 ± 2 ºC.

-Cápsulas metálicas, de porcelana, o de vidrio, resistentes a la corrosión, que tengan unas dimensiones mínimas de 25 mm de altura y 50 mm de diámetro.

-Crisoles filtrantes, de vidrio sintético, con porosidad número 3, y provistos en la trompa de matraces de filtración.

-Varilla con pieza final de material adecuado.

Reactivos necesarios.

-Éter de petróleo con límites de ebullición entre 30 y 60 ºC. En su defecto, usar éter de petróleo 40-60 ºC  (PRS). Este reactivo no debe dejar ningún residuo por evaporación.

Procedimiento analítico.

1.Preparación de la muestra: La muestra debe mezclarse con una varilla o un agitador mecánico, excepto cuando el mezclado no se considere necesario; en el caso de realizarse esta operación se hará lo más rápidamente posible, sin exceder de un minuto, y con unas condiciones de temperatura comprendidas entre 23-28 ºC, sin exceder nunca de 35 ºC. Antes de pesar la muestra deberá ponerse siempre a la temperatura ambiente.

2.Determinación de agua: Secar la cápsula en la estufa hasta masa constante, dejando enfriar la cápsula en desecador hasta la temperatura ambiente durante unos 30-35 minutos, y pesar la cápsula vacía. Seguidamente se pesan en la cápsula, de 5 a 10 g de la muestra de mantequilla, y se introduce en la estufa donde permanecerá al menos una hora; después se deja enfriar la cápsula en un desecador a la temperatura ambiente (30-35 minutos) y se pesa nuevamente. Se repite la operación del secado a intervalos de media hora hasta masa constante, con una variación igual o inferior a 0,5 mg, realizándose todas las pesadas con una precisión de 0,1 mg. En el caso de que aumente la masa, se toma la masa mínima para el cálculo. En esta determinación no deben emplearse materiales absorbentes.

3.Determinación del extracto seco magro: Secar el crisol de vidrio filtrante en la estufa hasta masa constante. Dejar enfriar el crisol a temperatura ambiente (30-35 minutos) y pesar. Añadir de 10 a 15 ml de éter de petróleo caliente a la cápsula que contiene el extracto seco procedente de la determinación de agua, de manera que se disuelva la grasa. Separar la mayor cantidad posible del sedimento adherido a la cápsula utilizando una varilla y pasar cuantitativamente la solución sobre la punta de la varilla al crisol. Repetir las operaciones cinco veces. Lavar el sedimento que queda en el crisol con 25 ml de éter de petróleo caliente. Secar la cápsula y el crisol en la estufa durante 2 horas; después se deja que la cápsula y el crisol se enfríen a la temperatura ambiente (30-35 minutos), procediendo a su pesaje. Hay que repetir las operaciones durante períodos de 30 minutos a la temperatura de secado hasta que la masa no disminuya mas. Todas las pesadas se harán con una precisión de 0,1 mg. 

Expresión de los resultados.

1-El contenido de agua de la mantequilla, expresado en porcentaje por masa, se obtiene por la fórmula siguiente:

Contenido de agua (en %) = 100 x (M - n) / M

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:

M = masa, en gramos, de la muestra.

n = masa, en gramos, de la muestra después del secado.

Para la determinación del contenido de agua, la diferencia entre el resultado de determinaciones paralelas no deberá exceder de 0,1 g de agua para 100 g de mantequilla.

2-El método de cálculo del extracto seco magro de la muestra de mantequilla se realiza mediante la siguiente fórmula:

Extracto seco magro = (A₂-A₁) + (B₂-B₁) x 100/ M

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:

A₁= masa, en gramos, del crisol vacío.

A₂= masa, en gramos, del crisol conteniendo sedimento.

B₁= masa, en gramos, de la cápsula vacía.

B₂= masa, en gramos, de la cápsula con sedimento residual.

M = masa, en gramos, de la muestra.

Para la determinación del contenido de extracto seco magro, la diferencia entre los resultados de determinaciones paralelas no deberá exceder de 0,05 g de extracto seco magro para 100 g de mantequilla.

3-El método de cálculo del contenido de grasa se realiza mediante la siguiente fórmula:

Contenido de grasa (en %) = 100 – (E + S)

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:

E = porcentaje, en masa, de agua (calculado mediante la fórmula del punto 1.).

S = porcentaje, en masa, de extracto seco magro (calculado con la fórmula del punto 2.).

Referencias.

-Métodos de análisis. Boletín Oficial del Estado (21/7/1977 y 22/7/1977).
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

MÉTODOS ANÁLISIS DE MANTEQUILLA: DEROGACIÓN EN ESPAÑA

Los métodos oficiales utilizados en España para la toma de muestras y análisis de la mantequilla, fueron aprobados por la Orden de 7 de enero de 1975. A continuación, se relacionan los distintos métodos oficiales que se incluyeron como Anejo único en la citada norma, así como su correspondencia con las normas de análisis nacionales e internacionales de los que emanan.

1-Determinación de acidez de la grasa: Se corresponde con la Norma FIL 6A: 1969.

2-Determinación del índice de refracción de la grasa: Se corresponde con la Norma FAO B-5: 1967.

3-Determinación del cloruro sódico: Se corresponde con la Norma FIL 12A: 1969.

4-Determinación de agua, extracto seco magro y grasa en una sola muestra: Se corresponde con la Norma FIL 80: 1977.

5-Detección de grasa vegetal en grasa de leche por cromatografía de gases de esteroles: Se corresponde con la Norma FIL 54: 1970.

6-Determinación de fosfatasa residual: Se corresponde con la Norma AOAC (Official Methods of analysis).

7-Determinación de los índices grasos volátiles solubles e insolubles: Se corresponde con la Norma FIL 37: 1966.

8-Determinación del índice de Kirschner: Se corresponde con la Norma AOCS 5-40.

9-Determinación de ácidos grasos de cadena corta: Se corresponde con la Norma UNE 55118.

Más información:

-Métodos de análisis en España. Boletín Oficial del Estado.
-Normas de la Federación Internacional de Lechería (FIL-IDF).
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban.
-Métodos de Análisis Lactológicos. Industrias Lácteas Españolas (ILE).

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: GRASA VEGETAL MANTEQUILLA-1

Continuando con las técnicas de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la detección de grasa vegetal en la mantequilla.

Principios y fundamentos metodológicos. 
Los digitónidos de esterol se disuelven en una mezcla de formamida y N,N-dimetilformamida, extrayendo con n-pentano los esteroles liberados, que se separan por cromatografía de gases. Si en el cromatograma obtenido se registra un pico con el tiempo de retención correspondiente al beta-sitosterol, se confirma la presencia de grasa vegetal en la muestra de mantequilla examinada.

Material y aparatos utilizados.
-Cromatógrafo de gases, equipado de un detector de ionización de llama, un inyector de plata o de vidrio con un sistema de inyección directa en la columna, y un registrador.
-Columna de cromatografía de gases, de vidrio o de acero inoxidable, en forma de U o en espiral, de 1 o 2 m de longitud, y un diámetro interior 3-4 mm. Se recomienda el vidrio, pues algunos tipos de acero inoxidable dan resultados erróneos por alteración de los esteroles.
-Microjeringa, para dosificaciones de 5 o 10 microlitros.

Reactivos necesarios.
-Agua destilada (PA).
-Alcohol etílico al 96% (v/v, PA).
-Colesterol (DC).
-Digitonina en solución alcohólica al 1%.
-N,N-Dimetilformamida (PA).
-Éter etílico (PA).
-Fitosterol de aceite de colza.
-Fitosterol de aceite de soja.
-Formamida (PRS).
-n-pentano (PA).
-Potasio hidróxido al 85% en lentejas (PA).

Se prepara una mezcla con volúmenes iguales de formamida (PRS) y N,N-Dimetilformamida (PA). En el relleno de la columna la fase estacionaria es de goma de silicona (típo metílico), estable hasta al menos una temperatura de 300 ºC que impregna en m2 a 4% una tierra de diatomeas calcinada, lavada al ácido y silanizada, de granulometría 80/100 o 100/120 de malla.
La solución para el ensayo de sensibilidad se prepara con 1 mg de colesterol (DC) de 1 ml de n-pentano (PA), recientemente obtenido a partir de la grasa de leche, del modo que se describe en el apartado del procedimiento analítico de los esteroles (punto 2).
La solución para el ensayo de resolución de los picos se prepara con 0,9 mg de fitosterol de aceite de colza y 0,1 mg de colesterol (DC) en 1 ml de n-pentano (PA). Los esteroles deben ser de reciente preparación, según el procedimiento analítico descrito (punto 2).
Asimismo, la solución para el ensayo de referencia se prepara con 1 mg de fitosterol de aceite de soja en 1 ml de n-pentano (PA) recientemente preparado, según se describe en el procedimiento analítico descrito (punto 2).
Como gas portador se utiliza el nitrógeno. También se utiliza el hidrógeno y el oxígeno (o aire).

Procedimiento analítico.
1.Preparación de la muestra: Fundir aproximadamente 50 g de la muestra de mantequilla en una estufa estándar a una temperatura inferior a 50 ºC, hasta conseguir la separación de las fases acuosa y grasa. Seguidamente, se separa la capa grasa por decantación y se procede a su clarificación en la estufa a una temperatura de unos 40 ºC; después se filtra sobre un papel de filtro seco, evitando el paso de la fase acuosa por el filtro.
2.Preparación de los esteroles: En un matraz erlenmeyer de 500 ml pesar aproximadamente 15 g de materia grasa, con una precisión de 0,1 g. Añadir 10 ml de solución de potasio hidróxido y 20 ml de alcohol etílico al 96% (v/v, PA). Colocar sobre el matraz erlenmeyer el refrigerante de aire, calentar en baño de agua hirviendo, agitando por rotación, hasta que la solución se vuelva clara, y continuar la ebullición durante 30 minutos más. Añadir 60 ml de agua destilada (PA), y luego 180 ml de alcohol etílico al 96% (v/v, PA) y elevar la temperatura a unos 40 ºC; añadir 30 ml de la solución alcohólica de dgitonina al 1%, agitar y dejar enfriar. Colocar el matraz en un refrigerante regulado a la temperatura de 5 ºC, aproximadamente, durante 12 horas o toda la noche. Recoger el precipitado del digitónido de esterol por filtración sobre un papel de filtro de velocidad media utilizando un embudo Buchner (8 cm de diámetro). Lavar el precipitado con agua destilada aproximadamente a unos 5 ºC de temperatura hasta que el filtrado no forme espuma; después se lava una vez con 25-50 ml de alcohol etílico al 96% (v/v, PA), y una vez con 25-50 ml de éter etílico (PA). Desecar el papel de filtro con el precipitado en un vidrio de reloj en estufa a 102 ± 2 ºC, durante 10 o 15 minutos. Separar el precipitado en forma de película, plegando en dos partes el papel de filtro. Disolver en un pequeño tubo de ensayo, aproximadamente, 10 mg de digitónido de esterol en 0,5 ml de una mezcla de volúmenes iguales de formamida (PRS) y N,N-Dimetilformamida (PA). En caso necesario, calentar ligeramente, enfriando después. Añadir 2,5 ml de n-pentano (PA) y agitar; dejar reposar hasta que la separación entre las capas sea nítida, y usar la capa superior para el análisis cromatográfico, ya que contiene los esteroles liberados.
3.Condiciones de la cromatografía de gases: La temperatura de la columna será de 220-250 ºC., la temperatura del sistema de inyección, si éste puede calentarse por separado, debe ser 20-40 ºC superior a la de la columna, y el gasto de nitrógeno se fija en 30/60 ml/min. Se debe desconectar el detector y equilibrar las columnas nuevas en estas condiciones durante 16-24 horas. Seguidamente, se conecta el detector, se enciende la llama, regulando el gasto de hidrógeno y de oxígeno o de aire con objeto de obtener una altura de llama y una sensibilidad adecuada. Poner en marcha el registrador y dejar que el papel se desenrolle a una velocidad adecuada, ajustar el cero y el atenuador. Si la línea de base es estable, el aparato está preparado para su utilización.
4.Ensayo de sensibilidad: Inyectar de 3 a 5 ml de la solución para el ensayo de sensibilidad, preparada previamente, apareciendo sólo un pico de colesterol en el cromatograma obtenido (figura 1). Ajustar el atenuador de modo que se utilice aproximadamente toda la escala del registrador. 

Figura 1. Esteroles de la materia grasa de la leche.

5.Ensayo de resolución de los picos: Inyectar de 3 a 5 ml de la solución para el ensayo de resolución de los picos, preparada previamente, apareciendo en el cromatograma los picos de colesterol, brasicosterol, y camposterol (figura 2). A continuación, medir las distancias de retención (distancia desde el punto de inyección hasta el punto de altura máxima del pico) para los siguientes picos: colesterol (d_ch), brasicosterol (d_b), camposterol (d_c), y beta-sitosterol (ds), así como las anchuras de la base de los picos (dimensión de retención entre las intersecciones con la línea de base de las tangentes en los puntos de inflexión situados en la parte anterior y posterior del pico), que corresponden al colesterol (W_ch), y al brasicosterol (W_b). La resolución de los picos se expresa mediante la siguiente fórmula:

PR = 2(d_b – d_ch) (W_b + W_ch), cuyo valor debe ser al menos igual a 1.

Asimismo, hay que calcular los tiempos de retención relativos (colesterol 1,00) para el brasicosterol, el camposterol y el beta-sitosterol.

Figura 2. Esteroles del aceite de colza.

6.Ensayo de referencia: Inyectar 3 a 5 ml de la solución para el ensayo de referencia, preparada previamente, apareciendo en el cromatograma los picos de camposterol, estigmasterol y beta-sitosterol (figura 3). A continuación, medir las distancias de retención de los picos correspondientes al camposterol (d_c), estigmasterol (d_st), y beta-sitosterol (d_s). Calcular los tiempos de retención relativos, que son, aproximadamente los siguientes:
-Colesterol: 1,00 (aproximadamente 15 minutos).
-Brasicosterol: 1,13-1,15.
-Camposterol: 1,32-1,34.
-Estigmasterol: 1,44-1,46.
-Beta-sitosterol: 1,66-1,68.

Figura 3. Esteroles del aceite de soja.

7.Análisis de la muestra: Inyectar de 3 a 5 ml de la solución a analizar y pulsar el botón del atenuador hasta obtener un factor de atenuación cuatro veces inferior, que generalmente se obtiene en dos pases del botón. A continuación, registrar el cromatograma obtenido.

Expresión de los resultados.
Si en el cromatograma obtenido aparece un pico con un tiempo de retención relativo igual al de beta-sitosterol y una altura que corresponde al menos a un 2% de la escala, se confirma la presencia de beta-sitosterol y la muestra de grasa examinada, a partir de la cual se han aislado los esteroles, se considera que contiene grasa vegetal. La presencia en el cromatograma de picos de otros fitosteroles como el camposterol o el estigmasterol, reafirma dicho resultado. 
Este método permite detectar la presencia de al menos un 0,5% de beta-sitosterol en la mezcla de esteroles. En principio, no es posible fijar el límite de detección de la grasa vegetal en la grasa de leche, debido a que depende del contenido en beta-sitosterol de la grasa añadida, es decir, de la naturaleza de esta grasa o de la mezcla de grasas añadidas a la grasa de leche.

Referencias.

-Métodos de análisis. Boletín Oficial del Estado (21/7/1977 y 22/7/1977).
-Norma Internacional FIL-IDF 54: 1970.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO ÁCIDOS GRASOS VOLÁTILES SOLUBLES E INSOLUBLES EN MANTEQUILLA-1

Continuando con las técnicas de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación del índice de ácidos grasos volátiles solubles e insolubles en la mantequilla.

Principios y fundamentos metodológicos. 
El índice de ácidos grasos volátiles solubles o índice de Reichert o Reichert-Meissl-Mellny, es el número de mililitros de una solución acuosa de álcali 0,1 N, requeridos para neutralizar los ácidos grasos volátiles solubles en agua de una cantidad de 5 gramos de grasa en las condiciones que se especifica en esta metodología. 
El índice de ácidos grasos volátiles insolubles o índice de Polenske, es el número de mililitros de solución acuosa de álcali 0,1 N, requeridos para neutralizar los ácidos grasos volátiles insolubles en agua, obtenidos en una muestra de 5 gramos de grasa, en las condiciones del método. 
Después de saponificar la grasa con una solución de sodio hidróxido en glicerina, la solución jabonosa se diluye con agua y se acidifica con ácido sulfúrico. Los ácidos grasos volátiles se destilan y los ácidos grasos insolubles se separan de los solubles por filtración. La solución acuosa de ácidos solubles y la solución etanólica de ácidos insolubles se valoran separadamente con una solución de álcali normalizada. El método es empírico porque sólo determina una parte de estos ácidos; por tanto, los aparatos utilizados y las especificaciones referentes al procedimiento se deben seguir rigurosamente para obtener resultados exactos y reproducibles.

Material y aparatos utilizados.
-Aparato de destilación (en esquema adjunto): Está integrado por los siguientes elementos:
1.Matraz de fondo plano de vidrio al borosilicato de 300 ml de capacidad (A).
2.Cabeza de destilación (E).
3.Refrigerante ( C).
4.Receptor, es un matraz aforado con las rayas circulares de aforo a 100 y 110 ml (D).
5.Lámina de amianto o asbesto de 120 mm de diámetro, 6 mm de espesor con una abertura central circular de 40 a 50 mm de diámetro, para sostener el matraz durante el calentamiento (E).
6.Piedra pómez triturada que pasa a través de un tamiz de malla circular de 1,44 mm.

En la figura se representan las dimensiones en mm y el montaje del aparato de destilación; para las conexiones se puede utilizar tapones de caucho, neopreno o silicona, o juntas de vidrio esmerilado “estandar” 24/40.

Reactivos necesarios.
-Ácido sulfúrico 1 N (SV).
-Agua destilada (PA).
-Alcohol etílico al 96% (v/v, PA).
-Fenolftaleína en solución al 1% ( RE).
-Glicerina (PRS).
-Piedra pómez de 4-8 mm ( PR).
-Sodio hidróxido al 97% en lentejas (PA).
-Sodio hidróxido 0,1 N ( SV).
-Indicador de fenolftaleína.

La glicerina empleada tiene las siguientes características: d = 1,26; 98% (p/p).
Para preparar la solución acuosa de sodio hidróxido (44% p/p) se usa sodio hidróxido al 97% en lentejas (PA), y se disuelve en agua destilada (PA). Se recomienda su conservación en una botella protegida del dióxido de carbono, y utilizar siempre la porción limpia libre de precipitado de carbonatos.
El agua destilada (PA) que se utilice en este método debe hervirse durante 15 minutos, para eliminar el dióxido de carbono.
La solución acuosa de sodio hidróxido 0,1 N (SV) o potasio hidróxido 0,1 N, debe estar normalizada exactamente.
El alcohol etílico al 96% (v/v PA) debe ser neutro a la fenolftaleína; el agua usada debe ser destilada o de una pureza al menos equivalente.

Procedimiento analítico.
1.Preparación de la muestra: Fundir aproximadamente 50 g de la muestra de mantequilla en una estufa estándar a una temperatura inferior a 50 ºC, hasta conseguir la separación de las fases acuosa y grasa; seguidamente, hay que separar la capa de grasa por decantación, y clarificarla en la estufa a unos 40 ºC; después se filtra empleando un papel de filtro seco, evitando que pase la fase acuosa por el filtro. 
2.Determinación del índice de ácidos grasos volátiles solubles: Pesar 5 g de grasa en el matraz A, con una aproximación de 0,01 g; añadir 20 g (16 ml) de glicerina (PRS), y 2 ml de solución de sodio hidróxido (44%). Para añadir la solución de sodio hidróxido debe usarse una bureta protegida de la entrada de dióxido de carbono, limpiando previamente la punta de la bureta y desechando las primeras gotas. Calentar el matraz a fuego directo, evitando el sobrecalentamiento, y agitando continuamente hasta que el líquido no forme espuma y se vuelva límpido. Dejar enfriar el matraz hasta 90 ºC, añadir 90 ml de agua destilada (PA) recién hervida a la misma temperatura aproximadamente, y mezclar hasta que el líquido obtenido sea límpido. Añadir de 0,6 a 0,7 g de piedra pómez y 50 ml de solución de ácido sulfúrico 1 N (SV). Conectar inmediatamente el matraz al aparato de destilación calentando ligeramente hasta que los ácidos grasos libres formen una capa superficial limpia. En el calentamiento debe regularse la llama de modo que se recojan en el matraz aforado 110 ml de destilado en unos 19-21 minutos, considerándose el comienzo de la destilación el momento en que se forma la primera gota en el refrigerante. Se debe regular el flujo de agua del refrigerante de modo que se mantenga la temperatura del agua que sale del mismo a 20 ± 1 ºC. Una vez recogidos los 110 ml de destilado, quitar el mechero inmediatamente y sustituir el matraz aforado por un pequeño vaso. A continuación, mezclar el contenido del matraz aforado agitando suavemente, y sumergir el matraz en un baño de agua a 20 ± 1 ºC durante 10-15 minutos, quedando la señal correspondiente a los 110 ml del matraz aforado por debajo del nivel del agua del baño; se debe agitar el matraz en varias ocasiones. Tapar el matraz y mezclar invirtiéndolo 4 o 5 veces sin agitar. Filtrar los 110 ml de destilado a través de un papel de filtro seco de velocidad media (diámetro 80-90 mm), que se ajusta en un embudo. El filtrado debe ser límpido, empleando un filtro con las dimensiones adecuadas para que un volumen de 15 ml lo llene por completo. Pipetar 100 ml de filtrado y pasarlos a un matraz erlenmeyer de 300 ml, añadir 0,5 ml de la solución indicadora de fenolftaleína al 1% (RE), y valorar con la solución acuosa de álcali “estándar” 0,1 N hasta obtener un color rosa persistente durante 30-60 segundos.
3.Ensayo en blanco: Se realiza sin grasa, y en lugar de saponificar a fuego directo hay que calentar en baño de agua hirviendo durante 15 minutos. Para la valoración es suficiente con emplear 0,5 ml de la solución de álcali normalizada. En caso contrario, se deben preparar nuevas soluciones del reactivo.
4.Determinación del índice de ácidos grasos volátiles insolubles (Polenske): Previamente, se debe lavar el filtro con tres volúmenes sucesivos de 15 ml de agua destilada (PA) a la temperatura de 20 ± 1 ºC, una vez que hayan pasado cada uno a través del refrigerante del vaso pequeño y del matraz aforado. Colocar el embudo y el filtro en el cuello de un matraz cónico, limpio y seco, de 200 ml de capacidad. Disolver los ácidos grasos insolubles repitiendo los lavados, usando volúmenes de 15 ml de alcohol etílico de 96% (v/v, PA). Valorar con la solución acuosa de álcali normalizada (0,1 N) el conjunto de los lavados utilizando alcohol etílico de 96% (v/v, PA), y 0,5 ml de solución indicadora de fenolftaleína al 1% (RE), hasta un color rosa persistente durante 30-60 segundos.

Expresión de los resultados.
Los distintos resultados se obtienen mediante las siguientes fórmulas:
1.Índice de ácidos grasos volátiles solubles (índice de Reichert):

Índice de Reichert = 11. t . (V₁ – b)

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
V₁ = Volumen en mililitros de la solución normalizada (0,1 N) de álcali, utilizados en la valoración de la muestra.
b = Volumen en mililitros de la solución normalizada (0,1 N) de álcali, utilizados en el ensayo en blanco.
t = Normalidad exacta de la solución normalizada (0,1 N) de álcali. 

El resultado obtenido se redondea a la primera cifra decimal.

2.Índice de ácidos grasos volátiles insolubles (índice de Polenske): 

Índice de Polenske = 10 . t . V₂

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
V₂ = Volumen en mililitros de la solución normalizada (0,1 N) de álcali utilizada en la valoración de la muestra.
t = Normalidad exacta de la solución normalizada (0,1 N) de álcali.

Se debe redondear el resultado a la primera cifra decimal.

3.Reproducción de los resultados: La diferencia entre los resultados de dos determinaciones duplicadas, obtenidos simultáneamente o inmediatamente uno detrás de otro por el mismo analista, no debe exceder de 0,5 para el índice de Reichert o de 0,3 para el índice de Polenske.

Referencias.

-Métodos de análisis. Boletín Oficial del Estado (21/7/1977 y 22/7/1977).
-Norma Internacional FIL-IDF 37: 1966.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: ÁCIDOS GRASOS CADENA CORTA EN MANTEQUILLA-1

Continuando con las técnicas de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación de los ácidos grasos de cadena corta en la mantequilla.

Principios y fundamentos metodológicos. 
El fundamento del método es la obtención de los ésteres metílicos de los ácidos grasos mediante la reacción con una solución de potasio hidróxido en alcohol metílico y la consiguiente inyección de la disolución de los ésteres metílicos directamente en el cromatógrafo. Este método es aplicable a las grasas de mantequillas u otras que contengan ácidos grasos de longitud de cadena inferior al C₁₄ y siempre que el contenido en ácidos libres no exceda de 1% expresados en ácido oleico.

Material y aparatos utilizados.
-Matraces con boca esmerilada y fondo redondo de 50 y 100 ml de capacidad.
-Pipetas aforadas de 1, 2 y 10 ml.
-Matraces aforados de 50 y 100 ml de capacidad.
-Probeta graduada de 10 ml.
-Jeringa de características adecuadas para la inyección de la muestra, graduada en décimas de ml, con una capacidad total de 1 a 10 ml.
-Cromatógrafo apto para trabajar en fase gaseosa, provisto de horno capaz de ser calentado hasta 250-300 ºC y sistema de regulación que permita controlar la temperatura con un error de ± 1,0 ºC. Equipado con programador de temperatura capaz de llevar la temperatura del horno de 60 ºC a 180 ºC a una velocidad de 4 ºC/minuto, y provisto de regulación independiente de la temperatura del inyector, que podrá ser calentado a una temperatura superior al menos en 50 ºC a la máxima alcanzable por el horno provisto de un sistema de detección sensible, de ionización de llama de hidrógeno, que pueda ser mantenido a la temperatura de la columna, a unos 50 ºC por encima de la del horno.
-Registrador con una tensión de entrada adecuada a la salida del amplificador del cromatógrafo, con una velocidad de respuesta mínima capaz de producir la deflexión completa de la escala en un segundo; y una velocidad de desplazamiento del papel de 5mm/min, que permita la posibilidad de variar esta velocidad, acelerando o retardando el desplazamiento.
-Tubo de nitrógeno a presión, utilizable como gas portador, debiendo tener una riqueza mínima del 99,8%.
-Tubos de hidrógeno y aire a presión necesarios para el caso en que se utilice detector de llama de hidrógeno. El hidrógeno deberá tener una riqueza mínima del 99,8%, debiendo además estar seco. Como medida de seguridad, es muy conveniente colocar a la entrada de los gases en el cromatógrafo, sendos tubos de desecación, provistos de tamiz molecular 13X.
-Columna cromatográfica: 
1.Columna que satisfaga las condiciones que se indican en las observaciones (punto 1).
2.Columna de vidrio con diámetro interior de 4 mm y una longitud aproximada de 2 mm. Rellenada con Chromosorb G, W o Q (80-100 mallas), conteniendo de 2,5 a 5% de un poliéster; pudiendo utilizarse cualquiera de los tres siguientes: dietilenglicolsuccinato (DEGS), etilenglicolsuccinato (EGS) o etilenglicoladipato (EGA), y polietilenglicoladipato (PEGA). 
Antes de emplear una columna nueva en la resolución de problemas analíticos, debe ser acondicionada, eliminando todos aquellos productos volátiles que pertubarían la buena marcha de la cromatografía. Para ello, la columna se monta en el cromatógrafo, sin conectarla al detector, y se calienta el horno a unos 10 ºC por encima de la temperatura máxima a que vaya a ser utilizada dicha columna en trabajos posteriores; haciendo pasar al mismo tiempo, una corriente de nitrógeno de 30 a 40 ml/minuto, que se mantiene durante 24 horas como mínimo. La columna será apta para su utilización si, una vez conectada al detector y en funcionamiento normal, la línea base dibujada por el registrador acusa la estabilidad del sistema.

Reactivos necesarios.
-Alcohol metílico (PA).
-Éter de petróleo de 40-60 ºC (PA).
-n-heptano (PA).
-Potasio hidróxido al 85% en lentejas (PA).

El éter de petróleo n-hexano deben tener un contenido en benceno no superior a 0,1%, además de cumplir el resto de las especificaciones en ambos reactivos. 
En la preparación de la disolución de potasio hidróxido 2 N en alcohol metílico se disuelven 11,2 g de potasio hidróxido al 85% en lentejas (PA) en 100 ml de alcohol metílico.
Los éteres metílicos deben tener la pureza adecuada para poder ser utilizados como patrones en cromatografía gaseosa. Para ello, se dispondrá de los ésteres metílicos de los ácidos mencionados a continuación, debiendo tener una pureza mínima de 99%, determinada por cromatografía gaseosa:
Ácido butanoico (butírico).
Ácido pentanoico (valeriánico).
Ácido hexanoico (caproico).
Ácido octanoico (caprílico).
Ácido decanoico (cáprico).
Ácido dodecanoico (laúrico).
Ácido tetradecanoico (mirístico).
Ácido hexadecanoico (palmítico).
Ácido octadecanoico (esteárico).
Ácido 9-octadecanoico (oleico).
Ácido 9,12-octadecadienoico (linoléico).
Ácido sicosanoico (aráquico).

La solución de referencia I se prepara en un matraz aforado de 50 ml donde se pesa 1 g de metilo pentanoato, con una exactitud de ±0,1 mg, disolviéndolo en n-heptano (PA), y completando hasta el volumen de enrase.
La solución de Referencia II se prepara en un matraz aforado de 100 ml donde se pesan 200 g de metilo pentanoato, con una exactitud de ±0,1 mg, disolviéndolo en n-heptano (PA), y completando hasta el volumen de enrase.

Procedimiento analítico.
1.Preparación de los ésteres metílicos: En un matraz de fondo redondo de 50 ml, pesar 1 g de grasa, con exactitud de ±0,1 mg, añadiendo 10 ml de éter de petróleo 40-60 ºC (PRS) o n-hexano (PA), y agitar suavemente hasta disolución de la grasa. En el caso de que se quiera efectuar una determinación cuantitativa de los ácidos butírico y caproico en la muestra, hay que agregar a la disolución en éter de petróleo de la grasa, 1 ml de la solución de referencia más adecuada, medida exactamente. En el caso de que las muestras contengan de 1 a 4% de ácido butírico se utilizará la solución de referencia I; en cambio, si contienen menos de 1% de ácido butírico se emplea la solución de referencia II. Si se desea efectuar solamente un análisis completo de la fracción de ácidos grasos, para lo que se aplica el método de normalización interna, no será necesario el empleo de la solución de referencia. A la solución en éter de petróleo de la muestra, adicionada o no de solución de referencia, se debe agregar 0,5 ml de disolución de potasio hidróxido 2 N, agitando la muestra hasta que se ponga transparente, durante un tiempo aproximado de 20-30 segundos. Casi inmediatamente después de observar la clarificación de la solución suele apreciarse un ligero enturbiamiento debido a la separación de glicerol, que se sedimenta rápidamente. Nada más terminada la reacción y observada la sedimentación, hay que tomar la cantidad necesaria con la jeringa e inyectarla en el cromatógrafo; una demora en la inyección de los ésteres metílicos daría lugar a la formación de jabones, con el consiguiente error en la determinación analítica.
2.Determinación cromatográfica: 
2.1.Condiciones de trabajo: 
-Temperatura de la columna: Temperatura programada de 60 a 160 ºC con una velocidad de 4 ºC/minuto.
-Temperatura del inyector: 200 ºC.
-Temperatura del detector: 200 ºC.
-Gas Portador: Nitrógeno (o helio) con flujo de 60 ml/min.
-Flujo de hidrógeno y aire para la alimentación del detector: Los flujos dependerán del tipo de detector utilizado, debiendo determinarse previamente para optimizar la respuesta.
-El registro obtenido del cromatograma: Debe satisfacer las condiciones establecidas a continuación; en caso contrario, se debe repetir la inyección modificando la cantidad inyectada o la sensibilidad de trabajo hasta obtener un cromatograma satisfactorio. 
Los requisitos exigibles son los siguientes:
a) El área total descrita en el registro, referida a la sensibilidad máxima utilizada en el curso de la operación, debe ser aproximadamente de 2.000 mm² con una velocidad del papel en el registrador de 5mm/minuto. De esta forma, los componentes presentes en una cuantía de 0,1% deben dar un pico, como mínimo de 2 mm² , siendo, por tanto perfectamente reconocibles.
b) Con el fin de conseguir que todos los picos caigan dentro del papel registrador, se utilizará, en cada caso, la atenuación de sensibilidad que sea necesaria, cuidando que el pico de mayor intensidad no sea atenuado más de ocho veces. Una vez conseguido un registro satisfactorio, y habiendo alcanzado nuevamente la pluma la línea base, se interrumpe el funcionamiento del registrador y se retira el papel con el registro para la identificación de los picos y/o cálculos cuantitativos.
2.2.Identificación de los picos. Se seguirán los criterios establecidos en el apartado de observaciones (punto 2).
2.3.Determinaciones cuantitativas: La determinación cuantitativa se basa en el principio de que los pesos de cada uno de los componentes separados en la mezcla son proporcionales a las áreas comprendidas dentro de los triángulos dibujados debajo de cada pico. El área de cada triángulo se obtiene trazando rectas tangentes a las líneas dibujadas en el registro, prolongándolas hasta su intersección con la línea base y multiplicando la altura del triángulo por la mitad de la base. En el caso de haber trabajado con atenuaciones diferentes para cada pico, se referirán todas las medidas a una misma sensibilidad del registrador, multiplicando la altura por el factor de atenuación correspondiente en cada caso, y el valor de la altura así corregida por la mitad de la base.
3.Determinación del contenido de los ácidos butírico y caproico en la materia grasa: Esta determinación se realiza por el método del patrón interno, siendo el patrón elegido el metilo pentanoato. 
3.1.Preparación de la mezcla de calibración: Con una exactitud de ±0,1 mg y en un matraz aforado de 50 ml, pesar unos 100 mg de cada uno de los siguientes patrones: metilo butanoato, metilo pentanoato y metilo caproato. Se disuelve la mezcla de n-heptano y se diluye completando hasta el volumen de enrase. Inyectar la cantidad necesaria de la solución anterior, normalmente 0,2-0,4 µl, para que, trabajando a la sensibilidad media del aparato, se consiga situar los máximos de los picos en una posición del 70-80% del recorrido total de la pluma del registrador. Los tres picos deberán registrarse a la misma sensibilidad. Si fuese necesario, se diluirá la solución anterior con n-heptano en la relación necesaria para poder ajustarse a las prescripciones fijadas. Efectuar, cuando menos, tres determinaciones consecutivas, que no deben discrepar entre sí mas del 1%.
4.Análisis cuantitativo de la totalidad de los componentes de la fracción de ácidos grasos, comprendiendo el C₄ al C₂₀ y el C_18:3
4.1.Preparación de la mezcla de calibración: Determinar previamente el factor de corrección para cada ácido componente de la mezcla, referido a uno cualquiera de ellos que se toma como patrón, eligiéndose normalmente para este fin el ácido palmítico y, debiendo tener la mezcla de calibración una composición análoga a la de la mezcla problema. Para ello, si no se conoce previamente el orden de composición del problema, se realizará una determinación cromatográfica de orientación, en el registro se hará la cuantificación de los componentes, con el mismo factor de respuesta para todos ellos, efectuando un reparto proporcional entre las áreas medidas. En un matraz aforado de 50 ml, pesar, con una exactitud de ±0,1 mg, las cantidades de los ésteres metílicos patrones que se indican a continuación proporcionales a las cifras de composición encontradas en el análisis de orientación anteriormente aludido, o previstas con anterioridad para la muestra. Los patrones que deben pasarse son los siguientes: metilo butanoato, metilo hexanoato, metilo octanoato, metilo decanoato, metilo dodecanoato, metilo tetradecanoato, metilo hexadecanoato, metilo octadecanoato, metilo oleato, metilo linoleato y metilo eicosanato. Se disuelve la mezcla de n-heptano agregando la cantidad adecuada de disolvente en relación al peso total de ésteres metílicos que se hayan pesado; para unos 50 ml de n-heptano (PA). A continuación inyectar 0,2-0,4µl para que, trabajando a la sensibilidad media del aparato, se consiga situar el máximo del pico correspondiente al componente mayoritario, en una posición del 70-80% del recorrido total de la pluma del registrador. Todos los picos deben registrarse a la misma sensibilidad, lo cual suele ser perfectamente factible en la grasa de leche; en aquellos casos en que la relación entre el pico mayoritario y el pico minoritario no permita registrar este último con las dimensiones adecuadas para efectuar una cuantificación correcta de su área, se podrá efectuar el cambio necesario en la atenuación del registro, procurando que éste no sobrepase la relación de 4:1. Si fuese necesario, se diluirá la solución con n-heptano en la relación necesaria para poder ajustarse a las prescripciones fijadas. Efectuar, cuando menos, tres determinaciones consecutivas, que no deben discrepar entre sí más del 1%.

Expresión de los resultados.
Los distintos resultados se obtienen mediante las siguientes fórmulas:
1-Cálculo de los factores de corrección para los ácidos butírico y caproico: Se determinan las áreas de los tres picos, siguiendo las normas que se contienen en el apartado ya descrito en la técnica de cromatografía de gases de esteroles, y se calculan los dos factores correspondientes al C₄ y C₆, del modo siguiente:

f_x = x. Ap/ P. A_x

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
f _x = factor de corrección del componente ácido x.
x = cantidad pesada del ácido x.
Ap = área medida en el registro para el patrón del pentanoato. 
A_x = área medida en el registro para el ácido x.
P = peso del patrón pentanoato.

2-Cálculo del contenido de ácidos: Los contenidos de ácido butírico y ácido caproico en la muestra de grasa de la mantequilla se calculan mediante la siguiente fórmula:

Contenido de ácidos (en %) = 100. f _x A_x P / Ap  M

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
f _x = factor de corrección determinado para cada ácido, según lo indicado en el apartado anterior.
A_x = área medida en el registro para el ácido x.
P = peso del patrón interno (pentanoato).
Ap = área medida en el registro para el patrón interno.
M = peso de la muestra de grasa.

3-Cálculo de los factores de corrección: Una vez determinadas las áreas de todos los picos, siguiendo las normas descritas en el procedimiento analítico, se calcula el factor de corrección de cada ácido, referido al ácido palmítico, como unidad de referencia, empleando la fórmula incluida en este apartado (punto 1), para lo que se sustituye el área Ap y el peso P del compuesto patrón por los valores correspondientes al metilo palmitato. 

4-Cálculo de la composición de la fracción de ácidos grasos: Se calcularán las áreas corregidas de cada uno de los componentes de la fracción multiplicando el área medida en el registro por el factor de corrección determinado según lo indicado en el apartado anterior (punto 3). El contenido de cada componente se calcula mediante la siguiente fórmula:

Fracción de ácidos grasos (en %) = X = 100. f _x A_x /  Σ(f_x . A_x)

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
f _x = factor de corrección del componente x.
A_x = área medida en el registro para el componente x.
Σ(f_x . A_x) = suma de todas las áreas corregidas correspondientes a los componentes de la fracción.

9.6. Observaciones: 
1.La puesta a punto de la columna se determina obteniendo la resolución de dos productos críticos como son el metilo oleato y el estearato. La resolución viene determinada por la siguiente expresión:

Resolución = 2 D/ O + E

siendo:
D = distancia entre los dos máximos de los picos del oleato y el estearato.
O = ancho de la base del pico correspondiente al oleato.
E = ancho de la base del pico correspondiente al estearato.

Estos valores se determinan sobre el cromatograma obtenido con una muestra conteniendo cantidades aproximadamente iguales de metilo estearato y oleato, inyectando una cantidad tal que la altura de estos picos alcance al 25-50% del ancho del papel de registro. Si la resolución calculada es igual o mayor que 1,0 la columna y el instrumento se encuentran en condiciones satisfactorias. Todas las columnas en el transcurso de su utilización sufren una pérdida gradual en la resolución de los picos; cuando el valor llegue a ser inferior a 1,0 deberá instalarse una nueva columna.
2.Para la identificación de los picos se pueden seguir los dos criterios siguientes:
2.1.Criterio basado en los tiempos de retención: Refiriéndose exclusivamente a los ácidos que entran normalmente en la composición de las grasas naturales, sus ésteres aparecen en el cromatograma en orden creciente de sus átomos de carbono y a su insaturación. Esto significa que el palmítico (C₁₆) aparece delante del esteárico (C₁₈), y los ésteres en C₁₈ aparecen en el orden estearato, oleato, linoleato y linolenato. El éster del ácido aráquico (C_20:0), usualmente, aparecen antes del linoléico (C₁₈:₃), pero en algunos casos puede ocurrir lo contrario, dependiendo del tipo de columna y de las condiciones de su utilización, o incluso superponerse uno al otro. Operando en condiciones constantes, los tiempos de retención son reproducibles en cada especie química, siendo el criterio más frecuente empleado para su identificación. El tiempo de retención viene dado por la distancia, medida en el cromatograma, entre el máximo del pico del aire y la posición del máximo de la banda. Trabajando con detector de llama de hidrógeno, la salida del aire no se detecta, pudiéndose escoger, en este caso, el momento en que se inicia la salida del disolvente, acusada por una fuerte deflexión de la pluma del registrador.
2.2.Criterio basado en los tiempos de retención relativos: Los tiempos de retención relativos son más reproducibles. Las retenciones relativas vienen determinadas por el cociente de dividir el tiempo de retención de cada pico por el tiempo registrado para el pico del metilo palmitato, o bien por otro éster que se tome como comparación, determinados todos ellos según el criterio expuesto en el párrafo anterior.

Referencias.

-Métodos de análisis. Boletín Oficial del Estado (21/7/1977 y 22/7/1977).
-Instituto de Racionalización y Normalización del Trabajo. Una Norma Española 55.118.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)