LABORATORIO: SACAROSA EN HELADOS-1

Continuando con los métodos oficiales de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica de la determinación de la sacarosa en los helados.

Principios y fundamentos metodológicos.
Este método se basa en el principio de inversión de Clerget, que consiste en un tratamiento suave con ácido que hidroliza completamente la sacarosa. La lactosa y los otros azúcares prácticamente no se hidrolizan. La cantidad de sacarosa se deduce del cambio de poder rotatorio de la solución.
Se prepara un filtrado límpido de la muestra, sin mutarrotación debida a la lactosa, por tratamiento de la solución con amoníaco seguido de neutralización y clarificación por adiciones sucesivas de acetato de cinc y de ferrocianuro potásico. En una parte del filtrado la sacarosa se hidroliza en las condiciones especiales que corresponde a este tipo de operación. Partiendo de los poderes rotatorios del filtrado, antes y después de la inversión, se calcula la cantidad de sacarosa.

Material y aparatos utilizados.
-Balanza analítica de sensibilidad 10 miligramos como mínimo.
-Vasos de precipitado, de 100 mililitros, de vidrio.
-Matraces graduados, de 200 y 50 mililitros.
-Pipetas, de 40 mililitros.
-Probetas graduadas, de 25 mililitros.
-Pipetas graduadas, de 10 militros.
-Embudo filtrante de diámetro entre 8 y 10 cm, y filtros (plegados) de 15 cm de diámetro.
-Tubo de polarímetro de 2 decímetros de longitud, exactamente calibrado.
-Polarímetro o sacarímetro.
-Polarímetro con luz de sodio o con luz verde de mercurio (lámpara de vapor de mercurio con prisma o pantalla Wratten nº 77A) permitiendo lecturas con una precisión por lo menos igual a 0,05 grados de ángulo.
-Sacarímetro con escala internacional de azúcar utilizando luz blanca, que pasa a través de un filtro de 15 milímetros de una solución al 6% de dicromato potásico, o bien luz de sodio, y permitiendo la lectura con una precisión por lo menos igual a 0,1 grados de la escala sacarimétrica internacional.
-Baño de agua a 60 ºC ± 1 ºC.

Reactivos necesarios.
-Acetato de cinc cristalizado: (C₂H₃O₂)₂Zn.2H₂O.
-Ácido acético glacial al 96%.
-Agua destilada.
-Ferrocianuro potásico cristalizado: Fe(CN)₆K₄.3H₂O. 
-Ácido clorhídrico fumante al 37%.
-Amoníaco al 25%.
Preparación de la solución de acetato de cinc 2,0 N: Disolver 21,9 g de acetato de cinc cristalizado en 3 ml de agua destilada, completando el volumen hasta 100 ml (enrase).
Preparación de la solución de ferrocianuro potásico 1,0 N: Disolver 10,6 g de ferrocianuro potásico cristalizado en agua destilada, y completar hasta 100 ml.
Preparación de la solución de ácido clorhídrico 6,35 ± 0,20 N (20-22%): Diluir 52,5 ml de ácido clorhídrico fumante (37%) en agua destilada, y completar hasta 100 ml.
Preparación de la solución diluida de amoníaco 2,0 ± 0,2 N (3,5%): Diluir 15,2 ml de solución de amoníaco (25%) en agua destilada, y completar hasta 100 ml.
Preparación de la solución diluida ácido acético 2,0 ± 0,20 N (12%): Diluir 11,8 ml de ácido acético glacial (96%) en agua destilada, y completar hasta 100 ml.

Procedimiento analítico.
1. Acondicionamiento de las muestras:
a) Para muestras de productos recientemente preparados en los que no se pueda prever separación alguna apreciable de los componentes:
Abrir el recipiente, introducir en él el producto adherido a la tapa y mediante un movimiento de arriba-abajo, con ayuda de una cuchara, conseguir que se mezclen íntimamente las capas superiores, así como el contenido del fondo del recipiente. Trasvasar el contenido del bote a un frasco provisto de tapón bien adaptado. 
b) Para muestras de productos más antiguos y muestras en las que se pueda prever una separación de componentes:
Calentar en baño de agua, aproximadamente a 40 ºC, hasta que la muestra casi haya alcanzado esta temperatura, abrir el recipiente y operar de la misma manera que en el punto a). En el caso de emplear un bote, hay que trasvasar su contenido a un frasco, raspar el producto que se haya adherido a las paredes y continuar la mezcla hasta que toda la masa sea homogénea. Cerrar el frasco con una tapadera que se adapte perfectamente. Dejar enfriar.
2. Comprobación del método:
Proceder como en el apartado 4.3, utilizando una mezcla de 100 g de leche o de 110 g de leche desnatada, y de 18 g de sacarosa pura, que corresponde a 40 g de una leche concentrada conteniendo el 45% de sacarosa. Calcular la cantidad de sacarosa como en el apartado 5.1, utilizando la fórmula (I), para W, F y P, la cantidad de leche pesada y la riqueza en materia grasa y proteínas de la leche, respectivamente; en la fórmula (II), para W, se utiliza la cifra de 40,00. Finalmente, se comprueba que la media de los valores encontrados no difiera de dicho valor (45%) en más de 0,1%.
3. Determinación:
3.1. En un vaso de 100 ml pesar aproximadamente 40 g de mezcla bien mezclada con una aproximación de 10 mg, y añadir 50 ml de agua destilada caliente (80-90 ºC) y mezclar cuidadosamente. Trasvasar cuantitativamente la mezcla a un matraz aforado de 200 ml, enjuagar el vaso con cantidades sucesivas de agua destilada a 60 ºC hasta alcanzar un volumen total de 120-150 ml. Mezclar y enfriar a temperatura ambiente. Añadir 5 ml de la solución de amoníaco diluida. Mezclar nuevamente y dejar reposar durante 15 minutos. Neutralizar el amoníaco añadiendo una cantidad equivalente de la solución diluida en ácido acético. Determinar previamente el volumen exacto (en ml) mediante la valoración de la solución de amoníaco diluida empleando el azul de bromotimol como indicador. Seguidamente se mezcla y se añade 12,5 ml de la solución de acetato, mezclando suavemente por rotación del matraz inclinado. Añadir 12,5 ml de la solución de ferrocianuro potásico. El contenido del matraz se pone a la temperatura de 20 ºC, y se añade agua destilada (a 20 ºC) hasta alcanzar el enrase de 200 mililitros. Tapar el matraz con un tapón seco y mezclar íntimamente sacudiendo con energía. Dejar reposar durante algunos minutos, filtrar a continuación por un papel de filtro seco, desechando los primeros 25 ml del filtrado.
Recomendación: Todas las adiciones de agua o de reactivos deberán hacerse de tal manera que se evite la formación de burbujas de aire; por este motivo, todas las mezclas deberán realizarse por rotación y no por agitación violenta. En el caso de observar la presencia de burbujas de aire antes de alcanzar los 200 ml deberán eliminarse aplicando al matraz una bomba de vacío e imprimiendo un movimiento de rotación. 
3.2. Polarización directa: Determinar la rotación óptica del filtrado a 20 ±2  ºC.
3.3. Inversión: Introducir con la pipeta en un matraz graduado de 50 ml, 40 ml del filtrado obtenido de la manera indicada anteriormente. Añadir 6,0 ml de ácido clorhídrico 6,35 N. Poner el matraz en baño de agua a 60 ºC durante 15 minutos, sumergiéndolo hasta el nacimiento del cuello del mismo. Mezclar por rotación durante los 5 primeros minutos, alcanzando el contenido la temperatura del baño de agua. Enfriar a 20 ºC, y completar hasta 50 ml con agua destilada a 20 ºC. Mezclar y dejar reposar a esta temperatura durante 60 minutos.
3.4. Polarización después de la inversión: Determinar el poder rotatorio de la solución invertida a 20 ± 2 ºC. En el caso de que la temperatura del líquido en el tubo de polarización difiera en más de 0,2 ºC del valor prefijado durante la medida (20 ºC), deberá aplicarse la corrección de la temperatura indicada en el apartado 5.2.

Expresión de los resultados.
Los distintos resultados se obtienen mediante las siguientes fórmulas:
1. Riqueza en sacarosa:
(I) υ= (1,08 F + 1,55 P) W/100
(II) S = D - l 5/4/ Q  x  V – v/ V  x  v/L.W  x  100
siendo:
S = Cantidad de sacarosa.
W = Peso de la muestra expresado en gramos.
P = Porcentaje de proteínas (N x 6,38) de la muestra.
F = Porcentaje en materia grasa de la muestra.
V = Volumen en mililitros de la muestra diluida antes de filtrar.
D = Lectura polarimétrica directa (polarización antes de la inversión).
l = Lectura polirimétrica después de la inversión.
L = Longitud en decímetros del tubo del polarímetro.
Q = Factor de inversión cuyos valores se indican más adelante.
Pesando exactamente 40,00 g de leche condensada y utilizando un polarímetro con luz de sodio provisto de escala en grados de ángulo y un tubo de 2 decímetros de longitud, el contenido en sacarosa de las leches condensadas normales (C=9) a 20,0 ± 1 ºC, se puede calcular con la siguiente fórmula:
S = (D – 5/4 I) x (2,833 – 0,00612 F – 0,00878 P)
Cuando la medida de la polarización después de la inversión se efectúa a una temperatura diferente de 20 ºC, las cifras obtenidas se deben multiplicar por la siguiente expresión: [(1 + 0,0037 (T – 20)].

2. Valores del factor de inversión Q:
Las fórmulas siguientes dan valores precisos de Q para diversas clases de luz con correcciones, si es necesario, para la concentración y la temperatura.
-Luz de sodio y polarímetro con escala en grados de ángulo:
Q = 0,8825 + 0,0006 (C-9) – 0,003 (T-20)
-Luz verde de mercurio y el polarímetro con escala de ángulo:
Q = 1,0392 + 0,0007 (C – 9) – 0,0039 (T-20)
-Luz blanca con filtro de dicromato y sacarímetro con escala sacarimétrica:
Q = 2,549  + 0,0017 (C – 9) – 0,0095 (T-20)
La nomenclatura de las fórmulas precedentes es:
C = Porcentaje de azúcares totales en la solución invertida, según la lectura polarimétrica.
T = Temperatura de la solución invertida en la lectura del polarímetro.
El porcentaje de azúcaes totales (C) en la solución invertida se puede calcular a partir de la lectura directa y de la variación después de la inversión según el método habitual, utilizando los valores usuales de rotación específica de sacarosa, de lactosa y de sacarosa invertida. La corrección 0,0006 (C-9), etc., no es exacta más que cuando C es aproximadamente 9; para la leche concentrada normal esta corrección se puede despreciar, por ser C próximo a 9.
Las variaciones en la temperatura del valor de 20 ºC influyen escasamente en la lectura de la polarización directa. Por el contrario, diferencias de más de 0,2 ºC en la lectura de polarización después de la inversión necesitan una corrección. La corrección -0,003 (T-20), etc., no es exacta más que para temperaturas comprendidas entre 18 ºC y 22 ºC.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente o de una inmediatamente después de otra, por el mismo analista, no debe ser mayor de 0,3 gramos de sacarosa por 100 gramos de leche concentrada.

Referencias.

-Métodos de Análisis Lactológicos. Industrias Lácteas Españolas, 1982.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: GRASA DE LA LECHE-3

Continuando con los métodos oficiales de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica de la materia grasa en leches concentrada, evaporada y condensada.

Principios y fundamentos metodológicos.
Este método es aplicable a las leches concentrada, evaporada y condensada, enteras o desnatadas, definidas en el Reglamento de Centrales Lecheras y otras Industrias Lácteas. En este sentido, se entiende por contenido en materia grasa de las leches concentrada, evaporada y condensada, el porcentaje en masa de las sustancias determinadas por el procedimiento expuesto a continuación, que corresponde al descrito en la norma FIL-13A: 1969 de la Federación Internacional de Lechería (FIL). El contenido en materia grasa se determina gravimétricamente por extracción de la citada materia grasa en una solución alcohólico-amoniacal del tipo de leche de que se trate, mediante éter etílico y éter de petróleo, evaporación de los disolventes y pesado del residuo, según el principio del método de Röse Gottlieb.

Material y aparatos utilizados.
-Balanza analítica.
-Probetas o matraces de extracción adecuados provistos de tapones de vidrio esmerilado, de tapones de corcho y otros dispositivos de cierre inatacables por los disolventes utilizados. Los tapones de corcho serán de buena calidad y se tratarán sometiéndolos sucesivamente a extracciones con éter etílico y con éter de petróleo. Después se introducirán, durante 20 minutos como mínimo, en agua a una temperatura de 60 ºC o incluso algo superior, y se dejarán enfriar también en agua con objeto de que estén saturados cuando se utilicen.
-Matraces de paredes delgadas y bases planas de una capacidad de 150 a 250 ml.
-Estufa de desecación bien ventilada y controlada termostáticamente, ajustada para que funcione a una temperatura de 102 ± 2 ºC, o bien en una estufa de desecación por vacío a temperatura entre 70-75 ºC, y presión menor de 50 mm de Hg).
-Materiales para facilitar la ebullición, exentos de materia grasa, no porosos ni deleznables al ser utilizados, como por ejemplo, perlas de vidrio o trozos de carburo de silicio, siendo su empleo de carácter facultativo.

Reactivos necesarios.
Todos los reactivos deben de ser de calidad pura para análisis (PA), y no dejar en la evaporación mayor cantidad de residuos que la autorizada para el ensayo en blanco. En caso necesario, los reactivos podrán destilarse de nuevo en presencia de 1 gramo, aproximadamente, de mantequilla deshidratada por 100 mililitros de disolvente. El agua que se utilice deberá ser destilada o por lo menos de igual pureza que el agua destilada.
Los reactivos necesarios son los siguientes:

-Agua destilada.

-Alcohol etílico del 96% (volumen/ volumen).

-Amonio hidróxido del 25% (en NH3).

-Cobre II sulfato 5-hidrato.

-Éter etílico.

-Éter de petróleo (40-60 º C).

-Potasio yoduro.

En el caso del amonio hidróxido del 25% (en NH3), puede tener una densidad aproximada a 20/4 de 0.910), o bien puede utilizarse una solución más concentrada, siempre que se conozca dicha concentración.
Se puede utilizar alcohol etílico del 96% (v/v) o, en su defecto, alcohol etílico desnaturalizado con alcohol metílico, metiletilcetona, benceno o éter de petróleo.
El éter etílico utilizado debe estar exento de peróxidos. En este sentido, para el ensayo de los peróxidos, hay que añadir a 10 ml de éter etílico mediante una pequeña probeta con tapón de vidrio, previamente enjuagada con un poco de éter, y 1 ml de solución al 10% de potasio yoduro recién preparada. A continuación, se agita y se deja reposar durante 1 minuto, no debiendo aparecer coloración amarilla en ninguna de las dos capas. Asimismo, el éter etílico puede mantenerse exento de peróxidos, añadiendo una lámina de zinc húmeda, que deberá sumergirse completamente en una solución ácida diluida de cobre II sulfato 5-hidrato durante 1 minuto, y lavarse después con agua destilada. En este caso, hay que utilizar, por litro de éter etílico, una superficie de 80 cm2 aproximadamente de lámina de zinc cortada en bandas lo suficientemente largas para que lleguen por lo menos, hasta el centro del recipiente.

El éter de petróleo debe tener su punto de ebullición entre los 30º y 60º C, o en su defecto, hay que usar éter de petróleo 40-60 ºC.

El disolvente mixto, debe prepararse poco tiempo antes de su utilización, mezclando volúmenes iguales de éter etílico y éter de petróleo. Asimismo, la mezcla de disolventes se podrá sustituir en aquellos casos en que su utilización esté prevista por éter etílico o por éter de petróleo.

Procedimiento analítico.
1.Preparación de la muestra: Se emplean dos tipos de técnicas, según la naturaleza de las muestras:
a)Leche concentrada y leche evaporada: Agitar e invertir el recipiente que contiene la muestra. Abrir y trasvasar lentamente la leche a un segundo recipiente provisto de cierre hermético. Mezclar mediante trasvases sucesivos, teniendo cuidado de incorporar a la muestra toda la materia grasa u otros constituyentes adheridos a las paredes o al fondo del primer recipiente. Finalmente, trasvasar la leche lo más completamente posible al segundo recipiente y cerrar este último. En caso necesario, templar el envase original, cerrado, en baño de María a 40-60 ºC. Sacarlo y agitar vigorosamente cada 15 minutos. Al cabo de 2 horas, retirar el envase y dejarlo enfriar hasta temperatura ambiente. Quitar totalmente la tapadera y mezclar cuidadosamente removiendo el contenido con una cuchara o espátula. Se debe tener en cuenta de que en el caso de que la materia grasa se separase del resto, no se debe efectuar el análisis de la muestra. Si se utilizan envases flexibles, es necesario abrirlos y trasvasar el contenido a un vaso. Raspar o rasgar los envases, previamente, con objeto de despegar todas la materias adheridas a las paredes e introducirlas en el vaso.
b)Leche condensada: Abrir el recipiente que contiene la muestra y mezclar cuidadosamente la leche con una cuchara o espátula. Imprimir a este instrumento un movimiento rotativo ascendente y descendente de manera que las capas superiores e inferiores se mezclen bien con el resto del contenido. Es necesario tener cuidado de reincorporar a la muestra toda la masa de leche que pudiera haberse adherido a las paredes y a los fondos del recipiente. Trasvasar la leche lo más completamente posible a un segundo recipiente provisto de cierre hermético, y cerrar este último. En caso necesario, templar el bote original, cerrado, en baño de María a 30-40 ºC. Abrir el bote, desprender toda la leche adherida a las paredes del mismo, y trasvasarla a una cápsula lo suficientemente grande para permitir un manejo cuidadoso, mezclándola hasta que toda la masa sea homogénea. Si se utilizan tubos flexibles, se abren y se trasvasa su contenido a un vaso, rasgando los tubos, con objeto de despegar todas las materias adheridas a las paredes antes de introducirlas en el vaso.
2.Ensayo en blanco: Al mismo tiempo que se determina el contenido en materia grasa de la muestra, se debe efectuar un ensayo en blanco con 10 ml de agua destilada (PA) en lugar de la muestra, empleando el mismo tipo de aparato de extracción, idénticos reactivos en iguales cantidades según el procedimiento que se describe a continuación. Si el resultado del ensayo en blanco excede 0,5 mg, habrá que comprobar los reactivos procediendo, en su caso, a su sustitución o purificación.
3.Determinación del parámetro composicional: Proceder igual que en la metodología ya descrita para el análisis de las leches natural, certificada, higienizada y esterilizada (ver entrada de este blog del día 19/02/2014, publicado hora: 04.39), excepto que en este caso hay que pesar de 4 a 5 gramos de la muestra, añadiendo a continuación 7 mililitros de agua destilada, agitando suavemente y calentando ligeramente (40-50 ºC), hasta la dispersión total del producto.

Expresión de los resultados.
Proceder igual que en la metodología ya descrita para el análisis de las leches natural, certificada, higienizada y esterilizada (ver entrada de este blog del día 19/02/2014, publicado hora: 04.39).

Referencias.

-Norma internacional FIL-IDF 13A: 1969.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: GRASA VEGETAL MANTEQUILLA-1

Continuando con las técnicas de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la detección de grasa vegetal en la mantequilla.

Principios y fundamentos metodológicos. 
Los digitónidos de esterol se disuelven en una mezcla de formamida y N,N-dimetilformamida, extrayendo con n-pentano los esteroles liberados, que se separan por cromatografía de gases. Si en el cromatograma obtenido se registra un pico con el tiempo de retención correspondiente al beta-sitosterol, se confirma la presencia de grasa vegetal en la muestra de mantequilla examinada.

Material y aparatos utilizados.
-Cromatógrafo de gases, equipado de un detector de ionización de llama, un inyector de plata o de vidrio con un sistema de inyección directa en la columna, y un registrador.
-Columna de cromatografía de gases, de vidrio o de acero inoxidable, en forma de U o en espiral, de 1 o 2 m de longitud, y un diámetro interior 3-4 mm. Se recomienda el vidrio, pues algunos tipos de acero inoxidable dan resultados erróneos por alteración de los esteroles.
-Microjeringa, para dosificaciones de 5 o 10 microlitros.

Reactivos necesarios.
-Agua destilada (PA).
-Alcohol etílico al 96% (v/v, PA).
-Colesterol (DC).
-Digitonina en solución alcohólica al 1%.
-N,N-Dimetilformamida (PA).
-Éter etílico (PA).
-Fitosterol de aceite de colza.
-Fitosterol de aceite de soja.
-Formamida (PRS).
-n-pentano (PA).
-Potasio hidróxido al 85% en lentejas (PA).

Se prepara una mezcla con volúmenes iguales de formamida (PRS) y N,N-Dimetilformamida (PA). En el relleno de la columna la fase estacionaria es de goma de silicona (típo metílico), estable hasta al menos una temperatura de 300 ºC que impregna en m2 a 4% una tierra de diatomeas calcinada, lavada al ácido y silanizada, de granulometría 80/100 o 100/120 de malla.
La solución para el ensayo de sensibilidad se prepara con 1 mg de colesterol (DC) de 1 ml de n-pentano (PA), recientemente obtenido a partir de la grasa de leche, del modo que se describe en el apartado del procedimiento analítico de los esteroles (punto 2).
La solución para el ensayo de resolución de los picos se prepara con 0,9 mg de fitosterol de aceite de colza y 0,1 mg de colesterol (DC) en 1 ml de n-pentano (PA). Los esteroles deben ser de reciente preparación, según el procedimiento analítico descrito (punto 2).
Asimismo, la solución para el ensayo de referencia se prepara con 1 mg de fitosterol de aceite de soja en 1 ml de n-pentano (PA) recientemente preparado, según se describe en el procedimiento analítico descrito (punto 2).
Como gas portador se utiliza el nitrógeno. También se utiliza el hidrógeno y el oxígeno (o aire).

Procedimiento analítico.
1.Preparación de la muestra: Fundir aproximadamente 50 g de la muestra de mantequilla en una estufa estándar a una temperatura inferior a 50 ºC, hasta conseguir la separación de las fases acuosa y grasa. Seguidamente, se separa la capa grasa por decantación y se procede a su clarificación en la estufa a una temperatura de unos 40 ºC; después se filtra sobre un papel de filtro seco, evitando el paso de la fase acuosa por el filtro.
2.Preparación de los esteroles: En un matraz erlenmeyer de 500 ml pesar aproximadamente 15 g de materia grasa, con una precisión de 0,1 g. Añadir 10 ml de solución de potasio hidróxido y 20 ml de alcohol etílico al 96% (v/v, PA). Colocar sobre el matraz erlenmeyer el refrigerante de aire, calentar en baño de agua hirviendo, agitando por rotación, hasta que la solución se vuelva clara, y continuar la ebullición durante 30 minutos más. Añadir 60 ml de agua destilada (PA), y luego 180 ml de alcohol etílico al 96% (v/v, PA) y elevar la temperatura a unos 40 ºC; añadir 30 ml de la solución alcohólica de dgitonina al 1%, agitar y dejar enfriar. Colocar el matraz en un refrigerante regulado a la temperatura de 5 ºC, aproximadamente, durante 12 horas o toda la noche. Recoger el precipitado del digitónido de esterol por filtración sobre un papel de filtro de velocidad media utilizando un embudo Buchner (8 cm de diámetro). Lavar el precipitado con agua destilada aproximadamente a unos 5 ºC de temperatura hasta que el filtrado no forme espuma; después se lava una vez con 25-50 ml de alcohol etílico al 96% (v/v, PA), y una vez con 25-50 ml de éter etílico (PA). Desecar el papel de filtro con el precipitado en un vidrio de reloj en estufa a 102 ± 2 ºC, durante 10 o 15 minutos. Separar el precipitado en forma de película, plegando en dos partes el papel de filtro. Disolver en un pequeño tubo de ensayo, aproximadamente, 10 mg de digitónido de esterol en 0,5 ml de una mezcla de volúmenes iguales de formamida (PRS) y N,N-Dimetilformamida (PA). En caso necesario, calentar ligeramente, enfriando después. Añadir 2,5 ml de n-pentano (PA) y agitar; dejar reposar hasta que la separación entre las capas sea nítida, y usar la capa superior para el análisis cromatográfico, ya que contiene los esteroles liberados.
3.Condiciones de la cromatografía de gases: La temperatura de la columna será de 220-250 ºC., la temperatura del sistema de inyección, si éste puede calentarse por separado, debe ser 20-40 ºC superior a la de la columna, y el gasto de nitrógeno se fija en 30/60 ml/min. Se debe desconectar el detector y equilibrar las columnas nuevas en estas condiciones durante 16-24 horas. Seguidamente, se conecta el detector, se enciende la llama, regulando el gasto de hidrógeno y de oxígeno o de aire con objeto de obtener una altura de llama y una sensibilidad adecuada. Poner en marcha el registrador y dejar que el papel se desenrolle a una velocidad adecuada, ajustar el cero y el atenuador. Si la línea de base es estable, el aparato está preparado para su utilización.
4.Ensayo de sensibilidad: Inyectar de 3 a 5 ml de la solución para el ensayo de sensibilidad, preparada previamente, apareciendo sólo un pico de colesterol en el cromatograma obtenido (figura 1). Ajustar el atenuador de modo que se utilice aproximadamente toda la escala del registrador. 

Figura 1. Esteroles de la materia grasa de la leche.

5.Ensayo de resolución de los picos: Inyectar de 3 a 5 ml de la solución para el ensayo de resolución de los picos, preparada previamente, apareciendo en el cromatograma los picos de colesterol, brasicosterol, y camposterol (figura 2). A continuación, medir las distancias de retención (distancia desde el punto de inyección hasta el punto de altura máxima del pico) para los siguientes picos: colesterol (d_ch), brasicosterol (d_b), camposterol (d_c), y beta-sitosterol (ds), así como las anchuras de la base de los picos (dimensión de retención entre las intersecciones con la línea de base de las tangentes en los puntos de inflexión situados en la parte anterior y posterior del pico), que corresponden al colesterol (W_ch), y al brasicosterol (W_b). La resolución de los picos se expresa mediante la siguiente fórmula:

PR = 2(d_b – d_ch) (W_b + W_ch), cuyo valor debe ser al menos igual a 1.

Asimismo, hay que calcular los tiempos de retención relativos (colesterol 1,00) para el brasicosterol, el camposterol y el beta-sitosterol.

Figura 2. Esteroles del aceite de colza.

6.Ensayo de referencia: Inyectar 3 a 5 ml de la solución para el ensayo de referencia, preparada previamente, apareciendo en el cromatograma los picos de camposterol, estigmasterol y beta-sitosterol (figura 3). A continuación, medir las distancias de retención de los picos correspondientes al camposterol (d_c), estigmasterol (d_st), y beta-sitosterol (d_s). Calcular los tiempos de retención relativos, que son, aproximadamente los siguientes:
-Colesterol: 1,00 (aproximadamente 15 minutos).
-Brasicosterol: 1,13-1,15.
-Camposterol: 1,32-1,34.
-Estigmasterol: 1,44-1,46.
-Beta-sitosterol: 1,66-1,68.

Figura 3. Esteroles del aceite de soja.

7.Análisis de la muestra: Inyectar de 3 a 5 ml de la solución a analizar y pulsar el botón del atenuador hasta obtener un factor de atenuación cuatro veces inferior, que generalmente se obtiene en dos pases del botón. A continuación, registrar el cromatograma obtenido.

Expresión de los resultados.
Si en el cromatograma obtenido aparece un pico con un tiempo de retención relativo igual al de beta-sitosterol y una altura que corresponde al menos a un 2% de la escala, se confirma la presencia de beta-sitosterol y la muestra de grasa examinada, a partir de la cual se han aislado los esteroles, se considera que contiene grasa vegetal. La presencia en el cromatograma de picos de otros fitosteroles como el camposterol o el estigmasterol, reafirma dicho resultado. 
Este método permite detectar la presencia de al menos un 0,5% de beta-sitosterol en la mezcla de esteroles. En principio, no es posible fijar el límite de detección de la grasa vegetal en la grasa de leche, debido a que depende del contenido en beta-sitosterol de la grasa añadida, es decir, de la naturaleza de esta grasa o de la mezcla de grasas añadidas a la grasa de leche.

Referencias.

-Métodos de análisis. Boletín Oficial del Estado (21/7/1977 y 22/7/1977).
-Norma Internacional FIL-IDF 54: 1970.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO ÁCIDOS GRASOS VOLÁTILES SOLUBLES E INSOLUBLES EN MANTEQUILLA-1

Continuando con las técnicas de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación del índice de ácidos grasos volátiles solubles e insolubles en la mantequilla.

Principios y fundamentos metodológicos. 
El índice de ácidos grasos volátiles solubles o índice de Reichert o Reichert-Meissl-Mellny, es el número de mililitros de una solución acuosa de álcali 0,1 N, requeridos para neutralizar los ácidos grasos volátiles solubles en agua de una cantidad de 5 gramos de grasa en las condiciones que se especifica en esta metodología. 
El índice de ácidos grasos volátiles insolubles o índice de Polenske, es el número de mililitros de solución acuosa de álcali 0,1 N, requeridos para neutralizar los ácidos grasos volátiles insolubles en agua, obtenidos en una muestra de 5 gramos de grasa, en las condiciones del método. 
Después de saponificar la grasa con una solución de sodio hidróxido en glicerina, la solución jabonosa se diluye con agua y se acidifica con ácido sulfúrico. Los ácidos grasos volátiles se destilan y los ácidos grasos insolubles se separan de los solubles por filtración. La solución acuosa de ácidos solubles y la solución etanólica de ácidos insolubles se valoran separadamente con una solución de álcali normalizada. El método es empírico porque sólo determina una parte de estos ácidos; por tanto, los aparatos utilizados y las especificaciones referentes al procedimiento se deben seguir rigurosamente para obtener resultados exactos y reproducibles.

Material y aparatos utilizados.
-Aparato de destilación (en esquema adjunto): Está integrado por los siguientes elementos:
1.Matraz de fondo plano de vidrio al borosilicato de 300 ml de capacidad (A).
2.Cabeza de destilación (E).
3.Refrigerante ( C).
4.Receptor, es un matraz aforado con las rayas circulares de aforo a 100 y 110 ml (D).
5.Lámina de amianto o asbesto de 120 mm de diámetro, 6 mm de espesor con una abertura central circular de 40 a 50 mm de diámetro, para sostener el matraz durante el calentamiento (E).
6.Piedra pómez triturada que pasa a través de un tamiz de malla circular de 1,44 mm.

En la figura se representan las dimensiones en mm y el montaje del aparato de destilación; para las conexiones se puede utilizar tapones de caucho, neopreno o silicona, o juntas de vidrio esmerilado “estandar” 24/40.

Reactivos necesarios.
-Ácido sulfúrico 1 N (SV).
-Agua destilada (PA).
-Alcohol etílico al 96% (v/v, PA).
-Fenolftaleína en solución al 1% ( RE).
-Glicerina (PRS).
-Piedra pómez de 4-8 mm ( PR).
-Sodio hidróxido al 97% en lentejas (PA).
-Sodio hidróxido 0,1 N ( SV).
-Indicador de fenolftaleína.

La glicerina empleada tiene las siguientes características: d = 1,26; 98% (p/p).
Para preparar la solución acuosa de sodio hidróxido (44% p/p) se usa sodio hidróxido al 97% en lentejas (PA), y se disuelve en agua destilada (PA). Se recomienda su conservación en una botella protegida del dióxido de carbono, y utilizar siempre la porción limpia libre de precipitado de carbonatos.
El agua destilada (PA) que se utilice en este método debe hervirse durante 15 minutos, para eliminar el dióxido de carbono.
La solución acuosa de sodio hidróxido 0,1 N (SV) o potasio hidróxido 0,1 N, debe estar normalizada exactamente.
El alcohol etílico al 96% (v/v PA) debe ser neutro a la fenolftaleína; el agua usada debe ser destilada o de una pureza al menos equivalente.

Procedimiento analítico.
1.Preparación de la muestra: Fundir aproximadamente 50 g de la muestra de mantequilla en una estufa estándar a una temperatura inferior a 50 ºC, hasta conseguir la separación de las fases acuosa y grasa; seguidamente, hay que separar la capa de grasa por decantación, y clarificarla en la estufa a unos 40 ºC; después se filtra empleando un papel de filtro seco, evitando que pase la fase acuosa por el filtro. 
2.Determinación del índice de ácidos grasos volátiles solubles: Pesar 5 g de grasa en el matraz A, con una aproximación de 0,01 g; añadir 20 g (16 ml) de glicerina (PRS), y 2 ml de solución de sodio hidróxido (44%). Para añadir la solución de sodio hidróxido debe usarse una bureta protegida de la entrada de dióxido de carbono, limpiando previamente la punta de la bureta y desechando las primeras gotas. Calentar el matraz a fuego directo, evitando el sobrecalentamiento, y agitando continuamente hasta que el líquido no forme espuma y se vuelva límpido. Dejar enfriar el matraz hasta 90 ºC, añadir 90 ml de agua destilada (PA) recién hervida a la misma temperatura aproximadamente, y mezclar hasta que el líquido obtenido sea límpido. Añadir de 0,6 a 0,7 g de piedra pómez y 50 ml de solución de ácido sulfúrico 1 N (SV). Conectar inmediatamente el matraz al aparato de destilación calentando ligeramente hasta que los ácidos grasos libres formen una capa superficial limpia. En el calentamiento debe regularse la llama de modo que se recojan en el matraz aforado 110 ml de destilado en unos 19-21 minutos, considerándose el comienzo de la destilación el momento en que se forma la primera gota en el refrigerante. Se debe regular el flujo de agua del refrigerante de modo que se mantenga la temperatura del agua que sale del mismo a 20 ± 1 ºC. Una vez recogidos los 110 ml de destilado, quitar el mechero inmediatamente y sustituir el matraz aforado por un pequeño vaso. A continuación, mezclar el contenido del matraz aforado agitando suavemente, y sumergir el matraz en un baño de agua a 20 ± 1 ºC durante 10-15 minutos, quedando la señal correspondiente a los 110 ml del matraz aforado por debajo del nivel del agua del baño; se debe agitar el matraz en varias ocasiones. Tapar el matraz y mezclar invirtiéndolo 4 o 5 veces sin agitar. Filtrar los 110 ml de destilado a través de un papel de filtro seco de velocidad media (diámetro 80-90 mm), que se ajusta en un embudo. El filtrado debe ser límpido, empleando un filtro con las dimensiones adecuadas para que un volumen de 15 ml lo llene por completo. Pipetar 100 ml de filtrado y pasarlos a un matraz erlenmeyer de 300 ml, añadir 0,5 ml de la solución indicadora de fenolftaleína al 1% (RE), y valorar con la solución acuosa de álcali “estándar” 0,1 N hasta obtener un color rosa persistente durante 30-60 segundos.
3.Ensayo en blanco: Se realiza sin grasa, y en lugar de saponificar a fuego directo hay que calentar en baño de agua hirviendo durante 15 minutos. Para la valoración es suficiente con emplear 0,5 ml de la solución de álcali normalizada. En caso contrario, se deben preparar nuevas soluciones del reactivo.
4.Determinación del índice de ácidos grasos volátiles insolubles (Polenske): Previamente, se debe lavar el filtro con tres volúmenes sucesivos de 15 ml de agua destilada (PA) a la temperatura de 20 ± 1 ºC, una vez que hayan pasado cada uno a través del refrigerante del vaso pequeño y del matraz aforado. Colocar el embudo y el filtro en el cuello de un matraz cónico, limpio y seco, de 200 ml de capacidad. Disolver los ácidos grasos insolubles repitiendo los lavados, usando volúmenes de 15 ml de alcohol etílico de 96% (v/v, PA). Valorar con la solución acuosa de álcali normalizada (0,1 N) el conjunto de los lavados utilizando alcohol etílico de 96% (v/v, PA), y 0,5 ml de solución indicadora de fenolftaleína al 1% (RE), hasta un color rosa persistente durante 30-60 segundos.

Expresión de los resultados.
Los distintos resultados se obtienen mediante las siguientes fórmulas:
1.Índice de ácidos grasos volátiles solubles (índice de Reichert):

Índice de Reichert = 11. t . (V₁ – b)

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
V₁ = Volumen en mililitros de la solución normalizada (0,1 N) de álcali, utilizados en la valoración de la muestra.
b = Volumen en mililitros de la solución normalizada (0,1 N) de álcali, utilizados en el ensayo en blanco.
t = Normalidad exacta de la solución normalizada (0,1 N) de álcali. 

El resultado obtenido se redondea a la primera cifra decimal.

2.Índice de ácidos grasos volátiles insolubles (índice de Polenske): 

Índice de Polenske = 10 . t . V₂

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
V₂ = Volumen en mililitros de la solución normalizada (0,1 N) de álcali utilizada en la valoración de la muestra.
t = Normalidad exacta de la solución normalizada (0,1 N) de álcali.

Se debe redondear el resultado a la primera cifra decimal.

3.Reproducción de los resultados: La diferencia entre los resultados de dos determinaciones duplicadas, obtenidos simultáneamente o inmediatamente uno detrás de otro por el mismo analista, no debe exceder de 0,5 para el índice de Reichert o de 0,3 para el índice de Polenske.

Referencias.

-Métodos de análisis. Boletín Oficial del Estado (21/7/1977 y 22/7/1977).
-Norma Internacional FIL-IDF 37: 1966.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: ÁCIDOS GRASOS CADENA CORTA EN MANTEQUILLA-1

Continuando con las técnicas de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación de los ácidos grasos de cadena corta en la mantequilla.

Principios y fundamentos metodológicos. 
El fundamento del método es la obtención de los ésteres metílicos de los ácidos grasos mediante la reacción con una solución de potasio hidróxido en alcohol metílico y la consiguiente inyección de la disolución de los ésteres metílicos directamente en el cromatógrafo. Este método es aplicable a las grasas de mantequillas u otras que contengan ácidos grasos de longitud de cadena inferior al C₁₄ y siempre que el contenido en ácidos libres no exceda de 1% expresados en ácido oleico.

Material y aparatos utilizados.
-Matraces con boca esmerilada y fondo redondo de 50 y 100 ml de capacidad.
-Pipetas aforadas de 1, 2 y 10 ml.
-Matraces aforados de 50 y 100 ml de capacidad.
-Probeta graduada de 10 ml.
-Jeringa de características adecuadas para la inyección de la muestra, graduada en décimas de ml, con una capacidad total de 1 a 10 ml.
-Cromatógrafo apto para trabajar en fase gaseosa, provisto de horno capaz de ser calentado hasta 250-300 ºC y sistema de regulación que permita controlar la temperatura con un error de ± 1,0 ºC. Equipado con programador de temperatura capaz de llevar la temperatura del horno de 60 ºC a 180 ºC a una velocidad de 4 ºC/minuto, y provisto de regulación independiente de la temperatura del inyector, que podrá ser calentado a una temperatura superior al menos en 50 ºC a la máxima alcanzable por el horno provisto de un sistema de detección sensible, de ionización de llama de hidrógeno, que pueda ser mantenido a la temperatura de la columna, a unos 50 ºC por encima de la del horno.
-Registrador con una tensión de entrada adecuada a la salida del amplificador del cromatógrafo, con una velocidad de respuesta mínima capaz de producir la deflexión completa de la escala en un segundo; y una velocidad de desplazamiento del papel de 5mm/min, que permita la posibilidad de variar esta velocidad, acelerando o retardando el desplazamiento.
-Tubo de nitrógeno a presión, utilizable como gas portador, debiendo tener una riqueza mínima del 99,8%.
-Tubos de hidrógeno y aire a presión necesarios para el caso en que se utilice detector de llama de hidrógeno. El hidrógeno deberá tener una riqueza mínima del 99,8%, debiendo además estar seco. Como medida de seguridad, es muy conveniente colocar a la entrada de los gases en el cromatógrafo, sendos tubos de desecación, provistos de tamiz molecular 13X.
-Columna cromatográfica: 
1.Columna que satisfaga las condiciones que se indican en las observaciones (punto 1).
2.Columna de vidrio con diámetro interior de 4 mm y una longitud aproximada de 2 mm. Rellenada con Chromosorb G, W o Q (80-100 mallas), conteniendo de 2,5 a 5% de un poliéster; pudiendo utilizarse cualquiera de los tres siguientes: dietilenglicolsuccinato (DEGS), etilenglicolsuccinato (EGS) o etilenglicoladipato (EGA), y polietilenglicoladipato (PEGA). 
Antes de emplear una columna nueva en la resolución de problemas analíticos, debe ser acondicionada, eliminando todos aquellos productos volátiles que pertubarían la buena marcha de la cromatografía. Para ello, la columna se monta en el cromatógrafo, sin conectarla al detector, y se calienta el horno a unos 10 ºC por encima de la temperatura máxima a que vaya a ser utilizada dicha columna en trabajos posteriores; haciendo pasar al mismo tiempo, una corriente de nitrógeno de 30 a 40 ml/minuto, que se mantiene durante 24 horas como mínimo. La columna será apta para su utilización si, una vez conectada al detector y en funcionamiento normal, la línea base dibujada por el registrador acusa la estabilidad del sistema.

Reactivos necesarios.
-Alcohol metílico (PA).
-Éter de petróleo de 40-60 ºC (PA).
-n-heptano (PA).
-Potasio hidróxido al 85% en lentejas (PA).

El éter de petróleo n-hexano deben tener un contenido en benceno no superior a 0,1%, además de cumplir el resto de las especificaciones en ambos reactivos. 
En la preparación de la disolución de potasio hidróxido 2 N en alcohol metílico se disuelven 11,2 g de potasio hidróxido al 85% en lentejas (PA) en 100 ml de alcohol metílico.
Los éteres metílicos deben tener la pureza adecuada para poder ser utilizados como patrones en cromatografía gaseosa. Para ello, se dispondrá de los ésteres metílicos de los ácidos mencionados a continuación, debiendo tener una pureza mínima de 99%, determinada por cromatografía gaseosa:
Ácido butanoico (butírico).
Ácido pentanoico (valeriánico).
Ácido hexanoico (caproico).
Ácido octanoico (caprílico).
Ácido decanoico (cáprico).
Ácido dodecanoico (laúrico).
Ácido tetradecanoico (mirístico).
Ácido hexadecanoico (palmítico).
Ácido octadecanoico (esteárico).
Ácido 9-octadecanoico (oleico).
Ácido 9,12-octadecadienoico (linoléico).
Ácido sicosanoico (aráquico).

La solución de referencia I se prepara en un matraz aforado de 50 ml donde se pesa 1 g de metilo pentanoato, con una exactitud de ±0,1 mg, disolviéndolo en n-heptano (PA), y completando hasta el volumen de enrase.
La solución de Referencia II se prepara en un matraz aforado de 100 ml donde se pesan 200 g de metilo pentanoato, con una exactitud de ±0,1 mg, disolviéndolo en n-heptano (PA), y completando hasta el volumen de enrase.

Procedimiento analítico.
1.Preparación de los ésteres metílicos: En un matraz de fondo redondo de 50 ml, pesar 1 g de grasa, con exactitud de ±0,1 mg, añadiendo 10 ml de éter de petróleo 40-60 ºC (PRS) o n-hexano (PA), y agitar suavemente hasta disolución de la grasa. En el caso de que se quiera efectuar una determinación cuantitativa de los ácidos butírico y caproico en la muestra, hay que agregar a la disolución en éter de petróleo de la grasa, 1 ml de la solución de referencia más adecuada, medida exactamente. En el caso de que las muestras contengan de 1 a 4% de ácido butírico se utilizará la solución de referencia I; en cambio, si contienen menos de 1% de ácido butírico se emplea la solución de referencia II. Si se desea efectuar solamente un análisis completo de la fracción de ácidos grasos, para lo que se aplica el método de normalización interna, no será necesario el empleo de la solución de referencia. A la solución en éter de petróleo de la muestra, adicionada o no de solución de referencia, se debe agregar 0,5 ml de disolución de potasio hidróxido 2 N, agitando la muestra hasta que se ponga transparente, durante un tiempo aproximado de 20-30 segundos. Casi inmediatamente después de observar la clarificación de la solución suele apreciarse un ligero enturbiamiento debido a la separación de glicerol, que se sedimenta rápidamente. Nada más terminada la reacción y observada la sedimentación, hay que tomar la cantidad necesaria con la jeringa e inyectarla en el cromatógrafo; una demora en la inyección de los ésteres metílicos daría lugar a la formación de jabones, con el consiguiente error en la determinación analítica.
2.Determinación cromatográfica: 
2.1.Condiciones de trabajo: 
-Temperatura de la columna: Temperatura programada de 60 a 160 ºC con una velocidad de 4 ºC/minuto.
-Temperatura del inyector: 200 ºC.
-Temperatura del detector: 200 ºC.
-Gas Portador: Nitrógeno (o helio) con flujo de 60 ml/min.
-Flujo de hidrógeno y aire para la alimentación del detector: Los flujos dependerán del tipo de detector utilizado, debiendo determinarse previamente para optimizar la respuesta.
-El registro obtenido del cromatograma: Debe satisfacer las condiciones establecidas a continuación; en caso contrario, se debe repetir la inyección modificando la cantidad inyectada o la sensibilidad de trabajo hasta obtener un cromatograma satisfactorio. 
Los requisitos exigibles son los siguientes:
a) El área total descrita en el registro, referida a la sensibilidad máxima utilizada en el curso de la operación, debe ser aproximadamente de 2.000 mm² con una velocidad del papel en el registrador de 5mm/minuto. De esta forma, los componentes presentes en una cuantía de 0,1% deben dar un pico, como mínimo de 2 mm² , siendo, por tanto perfectamente reconocibles.
b) Con el fin de conseguir que todos los picos caigan dentro del papel registrador, se utilizará, en cada caso, la atenuación de sensibilidad que sea necesaria, cuidando que el pico de mayor intensidad no sea atenuado más de ocho veces. Una vez conseguido un registro satisfactorio, y habiendo alcanzado nuevamente la pluma la línea base, se interrumpe el funcionamiento del registrador y se retira el papel con el registro para la identificación de los picos y/o cálculos cuantitativos.
2.2.Identificación de los picos. Se seguirán los criterios establecidos en el apartado de observaciones (punto 2).
2.3.Determinaciones cuantitativas: La determinación cuantitativa se basa en el principio de que los pesos de cada uno de los componentes separados en la mezcla son proporcionales a las áreas comprendidas dentro de los triángulos dibujados debajo de cada pico. El área de cada triángulo se obtiene trazando rectas tangentes a las líneas dibujadas en el registro, prolongándolas hasta su intersección con la línea base y multiplicando la altura del triángulo por la mitad de la base. En el caso de haber trabajado con atenuaciones diferentes para cada pico, se referirán todas las medidas a una misma sensibilidad del registrador, multiplicando la altura por el factor de atenuación correspondiente en cada caso, y el valor de la altura así corregida por la mitad de la base.
3.Determinación del contenido de los ácidos butírico y caproico en la materia grasa: Esta determinación se realiza por el método del patrón interno, siendo el patrón elegido el metilo pentanoato. 
3.1.Preparación de la mezcla de calibración: Con una exactitud de ±0,1 mg y en un matraz aforado de 50 ml, pesar unos 100 mg de cada uno de los siguientes patrones: metilo butanoato, metilo pentanoato y metilo caproato. Se disuelve la mezcla de n-heptano y se diluye completando hasta el volumen de enrase. Inyectar la cantidad necesaria de la solución anterior, normalmente 0,2-0,4 µl, para que, trabajando a la sensibilidad media del aparato, se consiga situar los máximos de los picos en una posición del 70-80% del recorrido total de la pluma del registrador. Los tres picos deberán registrarse a la misma sensibilidad. Si fuese necesario, se diluirá la solución anterior con n-heptano en la relación necesaria para poder ajustarse a las prescripciones fijadas. Efectuar, cuando menos, tres determinaciones consecutivas, que no deben discrepar entre sí mas del 1%.
4.Análisis cuantitativo de la totalidad de los componentes de la fracción de ácidos grasos, comprendiendo el C₄ al C₂₀ y el C_18:3
4.1.Preparación de la mezcla de calibración: Determinar previamente el factor de corrección para cada ácido componente de la mezcla, referido a uno cualquiera de ellos que se toma como patrón, eligiéndose normalmente para este fin el ácido palmítico y, debiendo tener la mezcla de calibración una composición análoga a la de la mezcla problema. Para ello, si no se conoce previamente el orden de composición del problema, se realizará una determinación cromatográfica de orientación, en el registro se hará la cuantificación de los componentes, con el mismo factor de respuesta para todos ellos, efectuando un reparto proporcional entre las áreas medidas. En un matraz aforado de 50 ml, pesar, con una exactitud de ±0,1 mg, las cantidades de los ésteres metílicos patrones que se indican a continuación proporcionales a las cifras de composición encontradas en el análisis de orientación anteriormente aludido, o previstas con anterioridad para la muestra. Los patrones que deben pasarse son los siguientes: metilo butanoato, metilo hexanoato, metilo octanoato, metilo decanoato, metilo dodecanoato, metilo tetradecanoato, metilo hexadecanoato, metilo octadecanoato, metilo oleato, metilo linoleato y metilo eicosanato. Se disuelve la mezcla de n-heptano agregando la cantidad adecuada de disolvente en relación al peso total de ésteres metílicos que se hayan pesado; para unos 50 ml de n-heptano (PA). A continuación inyectar 0,2-0,4µl para que, trabajando a la sensibilidad media del aparato, se consiga situar el máximo del pico correspondiente al componente mayoritario, en una posición del 70-80% del recorrido total de la pluma del registrador. Todos los picos deben registrarse a la misma sensibilidad, lo cual suele ser perfectamente factible en la grasa de leche; en aquellos casos en que la relación entre el pico mayoritario y el pico minoritario no permita registrar este último con las dimensiones adecuadas para efectuar una cuantificación correcta de su área, se podrá efectuar el cambio necesario en la atenuación del registro, procurando que éste no sobrepase la relación de 4:1. Si fuese necesario, se diluirá la solución con n-heptano en la relación necesaria para poder ajustarse a las prescripciones fijadas. Efectuar, cuando menos, tres determinaciones consecutivas, que no deben discrepar entre sí más del 1%.

Expresión de los resultados.
Los distintos resultados se obtienen mediante las siguientes fórmulas:
1-Cálculo de los factores de corrección para los ácidos butírico y caproico: Se determinan las áreas de los tres picos, siguiendo las normas que se contienen en el apartado ya descrito en la técnica de cromatografía de gases de esteroles, y se calculan los dos factores correspondientes al C₄ y C₆, del modo siguiente:

f_x = x. Ap/ P. A_x

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
f _x = factor de corrección del componente ácido x.
x = cantidad pesada del ácido x.
Ap = área medida en el registro para el patrón del pentanoato. 
A_x = área medida en el registro para el ácido x.
P = peso del patrón pentanoato.

2-Cálculo del contenido de ácidos: Los contenidos de ácido butírico y ácido caproico en la muestra de grasa de la mantequilla se calculan mediante la siguiente fórmula:

Contenido de ácidos (en %) = 100. f _x A_x P / Ap  M

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
f _x = factor de corrección determinado para cada ácido, según lo indicado en el apartado anterior.
A_x = área medida en el registro para el ácido x.
P = peso del patrón interno (pentanoato).
Ap = área medida en el registro para el patrón interno.
M = peso de la muestra de grasa.

3-Cálculo de los factores de corrección: Una vez determinadas las áreas de todos los picos, siguiendo las normas descritas en el procedimiento analítico, se calcula el factor de corrección de cada ácido, referido al ácido palmítico, como unidad de referencia, empleando la fórmula incluida en este apartado (punto 1), para lo que se sustituye el área Ap y el peso P del compuesto patrón por los valores correspondientes al metilo palmitato. 

4-Cálculo de la composición de la fracción de ácidos grasos: Se calcularán las áreas corregidas de cada uno de los componentes de la fracción multiplicando el área medida en el registro por el factor de corrección determinado según lo indicado en el apartado anterior (punto 3). El contenido de cada componente se calcula mediante la siguiente fórmula:

Fracción de ácidos grasos (en %) = X = 100. f _x A_x /  Σ(f_x . A_x)

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
f _x = factor de corrección del componente x.
A_x = área medida en el registro para el componente x.
Σ(f_x . A_x) = suma de todas las áreas corregidas correspondientes a los componentes de la fracción.

9.6. Observaciones: 
1.La puesta a punto de la columna se determina obteniendo la resolución de dos productos críticos como son el metilo oleato y el estearato. La resolución viene determinada por la siguiente expresión:

Resolución = 2 D/ O + E

siendo:
D = distancia entre los dos máximos de los picos del oleato y el estearato.
O = ancho de la base del pico correspondiente al oleato.
E = ancho de la base del pico correspondiente al estearato.

Estos valores se determinan sobre el cromatograma obtenido con una muestra conteniendo cantidades aproximadamente iguales de metilo estearato y oleato, inyectando una cantidad tal que la altura de estos picos alcance al 25-50% del ancho del papel de registro. Si la resolución calculada es igual o mayor que 1,0 la columna y el instrumento se encuentran en condiciones satisfactorias. Todas las columnas en el transcurso de su utilización sufren una pérdida gradual en la resolución de los picos; cuando el valor llegue a ser inferior a 1,0 deberá instalarse una nueva columna.
2.Para la identificación de los picos se pueden seguir los dos criterios siguientes:
2.1.Criterio basado en los tiempos de retención: Refiriéndose exclusivamente a los ácidos que entran normalmente en la composición de las grasas naturales, sus ésteres aparecen en el cromatograma en orden creciente de sus átomos de carbono y a su insaturación. Esto significa que el palmítico (C₁₆) aparece delante del esteárico (C₁₈), y los ésteres en C₁₈ aparecen en el orden estearato, oleato, linoleato y linolenato. El éster del ácido aráquico (C_20:0), usualmente, aparecen antes del linoléico (C₁₈:₃), pero en algunos casos puede ocurrir lo contrario, dependiendo del tipo de columna y de las condiciones de su utilización, o incluso superponerse uno al otro. Operando en condiciones constantes, los tiempos de retención son reproducibles en cada especie química, siendo el criterio más frecuente empleado para su identificación. El tiempo de retención viene dado por la distancia, medida en el cromatograma, entre el máximo del pico del aire y la posición del máximo de la banda. Trabajando con detector de llama de hidrógeno, la salida del aire no se detecta, pudiéndose escoger, en este caso, el momento en que se inicia la salida del disolvente, acusada por una fuerte deflexión de la pluma del registrador.
2.2.Criterio basado en los tiempos de retención relativos: Los tiempos de retención relativos son más reproducibles. Las retenciones relativas vienen determinadas por el cociente de dividir el tiempo de retención de cada pico por el tiempo registrado para el pico del metilo palmitato, o bien por otro éster que se tome como comparación, determinados todos ellos según el criterio expuesto en el párrafo anterior.

Referencias.

-Métodos de análisis. Boletín Oficial del Estado (21/7/1977 y 22/7/1977).
-Instituto de Racionalización y Normalización del Trabajo. Una Norma Española 55.118.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)