Continuando con las técnicas de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación de los ácidos grasos de cadena corta en la mantequilla.
Principios y fundamentos metodológicos.
El fundamento del método es la obtención de los ésteres metílicos de los ácidos grasos mediante la reacción con una solución de potasio hidróxido en alcohol metílico y la consiguiente inyección de la disolución de los ésteres metílicos directamente en el cromatógrafo. Este método es aplicable a las grasas de mantequillas u otras que contengan ácidos grasos de longitud de cadena inferior al C14 y siempre que el contenido en ácidos libres no exceda de 1% expresados en ácido oleico.
Material y aparatos utilizados.
-Matraces con boca esmerilada y fondo redondo de 50 y 100 ml de capacidad.
-Pipetas aforadas de 1, 2 y 10 ml.
-Matraces aforados de 50 y 100 ml de capacidad.
-Probeta graduada de 10 ml.
-Jeringa de características adecuadas para la inyección de la muestra, graduada en décimas de ml, con una capacidad total de 1 a 10 ml.
-Cromatógrafo apto para trabajar en fase gaseosa, provisto de horno capaz de ser calentado hasta 250-300 ºC y sistema de regulación que permita controlar la temperatura con un error de ± 1,0 ºC. Equipado con programador de temperatura capaz de llevar la temperatura del horno de 60 ºC a 180 ºC a una velocidad de 4 ºC/minuto, y provisto de regulación independiente de la temperatura del inyector, que podrá ser calentado a una temperatura superior al menos en 50 ºC a la máxima alcanzable por el horno provisto de un sistema de detección sensible, de ionización de llama de hidrógeno, que pueda ser mantenido a la temperatura de la columna, a unos 50 ºC por encima de la del horno.
-Registrador con una tensión de entrada adecuada a la salida del amplificador del cromatógrafo, con una velocidad de respuesta mínima capaz de producir la deflexión completa de la escala en un segundo; y una velocidad de desplazamiento del papel de 5mm/min, que permita la posibilidad de variar esta velocidad, acelerando o retardando el desplazamiento.
-Tubo de nitrógeno a presión, utilizable como gas portador, debiendo tener una riqueza mínima del 99,8%.
-Tubos de hidrógeno y aire a presión necesarios para el caso en que se utilice detector de llama de hidrógeno. El hidrógeno deberá tener una riqueza mínima del 99,8%, debiendo además estar seco. Como medida de seguridad, es muy conveniente colocar a la entrada de los gases en el cromatógrafo, sendos tubos de desecación, provistos de tamiz molecular 13X.
-Columna cromatográfica:
1.Columna que satisfaga las condiciones que se indican en las observaciones (punto 1).
2.Columna de vidrio con diámetro interior de 4 mm y una longitud aproximada de 2 mm. Rellenada con Chromosorb G, W o Q (80-100 mallas), conteniendo de 2,5 a 5% de un poliéster; pudiendo utilizarse cualquiera de los tres siguientes: dietilenglicolsuccinato (DEGS), etilenglicolsuccinato (EGS) o etilenglicoladipato (EGA), y polietilenglicoladipato (PEGA).
Antes de emplear una columna nueva en la resolución de problemas analíticos, debe ser acondicionada, eliminando todos aquellos productos volátiles que pertubarían la buena marcha de la cromatografía. Para ello, la columna se monta en el cromatógrafo, sin conectarla al detector, y se calienta el horno a unos 10 ºC por encima de la temperatura máxima a que vaya a ser utilizada dicha columna en trabajos posteriores; haciendo pasar al mismo tiempo, una corriente de nitrógeno de 30 a 40 ml/minuto, que se mantiene durante 24 horas como mínimo. La columna será apta para su utilización si, una vez conectada al detector y en funcionamiento normal, la línea base dibujada por el registrador acusa la estabilidad del sistema.
Reactivos necesarios.
-Alcohol metílico (PA).
-Éter de petróleo de 40-60 ºC (PA).
-n-heptano (PA).
-Potasio hidróxido al 85% en lentejas (PA).
El éter de petróleo n-hexano deben tener un contenido en benceno no superior a 0,1%, además de cumplir el resto de las especificaciones en ambos reactivos.
En la preparación de la disolución de potasio hidróxido 2 N en alcohol metílico se disuelven 11,2 g de potasio hidróxido al 85% en lentejas (PA) en 100 ml de alcohol metílico.
Los éteres metílicos deben tener la pureza adecuada para poder ser utilizados como patrones en cromatografía gaseosa. Para ello, se dispondrá de los ésteres metílicos de los ácidos mencionados a continuación, debiendo tener una pureza mínima de 99%, determinada por cromatografía gaseosa:
Ácido butanoico (butírico).
Ácido pentanoico (valeriánico).
Ácido hexanoico (caproico).
Ácido octanoico (caprílico).
Ácido decanoico (cáprico).
Ácido dodecanoico (laúrico).
Ácido tetradecanoico (mirístico).
Ácido hexadecanoico (palmítico).
Ácido octadecanoico (esteárico).
Ácido 9-octadecanoico (oleico).
Ácido 9,12-octadecadienoico (linoléico).
Ácido sicosanoico (aráquico).
La solución de referencia I se prepara en un matraz aforado de 50 ml donde se pesa 1 g de metilo pentanoato, con una exactitud de ±0,1 mg, disolviéndolo en n-heptano (PA), y completando hasta el volumen de enrase.
La solución de Referencia II se prepara en un matraz aforado de 100 ml donde se pesan 200 g de metilo pentanoato, con una exactitud de ±0,1 mg, disolviéndolo en n-heptano (PA), y completando hasta el volumen de enrase.
Procedimiento analítico.
1.Preparación de los ésteres metílicos: En un matraz de fondo redondo de 50 ml, pesar 1 g de grasa, con exactitud de ±0,1 mg, añadiendo 10 ml de éter de petróleo 40-60 ºC (PRS) o n-hexano (PA), y agitar suavemente hasta disolución de la grasa. En el caso de que se quiera efectuar una determinación cuantitativa de los ácidos butírico y caproico en la muestra, hay que agregar a la disolución en éter de petróleo de la grasa, 1 ml de la solución de referencia más adecuada, medida exactamente. En el caso de que las muestras contengan de 1 a 4% de ácido butírico se utilizará la solución de referencia I; en cambio, si contienen menos de 1% de ácido butírico se emplea la solución de referencia II. Si se desea efectuar solamente un análisis completo de la fracción de ácidos grasos, para lo que se aplica el método de normalización interna, no será necesario el empleo de la solución de referencia. A la solución en éter de petróleo de la muestra, adicionada o no de solución de referencia, se debe agregar 0,5 ml de disolución de potasio hidróxido 2 N, agitando la muestra hasta que se ponga transparente, durante un tiempo aproximado de 20-30 segundos. Casi inmediatamente después de observar la clarificación de la solución suele apreciarse un ligero enturbiamiento debido a la separación de glicerol, que se sedimenta rápidamente. Nada más terminada la reacción y observada la sedimentación, hay que tomar la cantidad necesaria con la jeringa e inyectarla en el cromatógrafo; una demora en la inyección de los ésteres metílicos daría lugar a la formación de jabones, con el consiguiente error en la determinación analítica.
2.Determinación cromatográfica:
2.1.Condiciones de trabajo:
-Temperatura de la columna: Temperatura programada de 60 a 160 ºC con una velocidad de 4 ºC/minuto.
-Temperatura del inyector: 200 ºC.
-Temperatura del detector: 200 ºC.
-Gas Portador: Nitrógeno (o helio) con flujo de 60 ml/min.
-Flujo de hidrógeno y aire para la alimentación del detector: Los flujos dependerán del tipo de detector utilizado, debiendo determinarse previamente para optimizar la respuesta.
-El registro obtenido del cromatograma: Debe satisfacer las condiciones establecidas a continuación; en caso contrario, se debe repetir la inyección modificando la cantidad inyectada o la sensibilidad de trabajo hasta obtener un cromatograma satisfactorio.
Los requisitos exigibles son los siguientes:
a) El área total descrita en el registro, referida a la sensibilidad máxima utilizada en el curso de la operación, debe ser aproximadamente de 2.000 mm2 con una velocidad del papel en el registrador de 5mm/minuto. De esta forma, los componentes presentes en una cuantía de 0,1% deben dar un pico, como mínimo de 2 mm2 , siendo, por tanto perfectamente reconocibles.
b) Con el fin de conseguir que todos los picos caigan dentro del papel registrador, se utilizará, en cada caso, la atenuación de sensibilidad que sea necesaria, cuidando que el pico de mayor intensidad no sea atenuado más de ocho veces. Una vez conseguido un registro satisfactorio, y habiendo alcanzado nuevamente la pluma la línea base, se interrumpe el funcionamiento del registrador y se retira el papel con el registro para la identificación de los picos y/o cálculos cuantitativos.
2.2.Identificación de los picos. Se seguirán los criterios establecidos en el apartado de observaciones (punto 2).
2.3.Determinaciones cuantitativas: La determinación cuantitativa se basa en el principio de que los pesos de cada uno de los componentes separados en la mezcla son proporcionales a las áreas comprendidas dentro de los triángulos dibujados debajo de cada pico. El área de cada triángulo se obtiene trazando rectas tangentes a las líneas dibujadas en el registro, prolongándolas hasta su intersección con la línea base y multiplicando la altura del triángulo por la mitad de la base. En el caso de haber trabajado con atenuaciones diferentes para cada pico, se referirán todas las medidas a una misma sensibilidad del registrador, multiplicando la altura por el factor de atenuación correspondiente en cada caso, y el valor de la altura así corregida por la mitad de la base.
3.Determinación del contenido de los ácidos butírico y caproico en la materia grasa: Esta determinación se realiza por el método del patrón interno, siendo el patrón elegido el metilo pentanoato.
3.1.Preparación de la mezcla de calibración: Con una exactitud de ±0,1 mg y en un matraz aforado de 50 ml, pesar unos 100 mg de cada uno de los siguientes patrones: metilo butanoato, metilo pentanoato y metilo caproato. Se disuelve la mezcla de n-heptano y se diluye completando hasta el volumen de enrase. Inyectar la cantidad necesaria de la solución anterior, normalmente 0,2-0,4 µl, para que, trabajando a la sensibilidad media del aparato, se consiga situar los máximos de los picos en una posición del 70-80% del recorrido total de la pluma del registrador. Los tres picos deberán registrarse a la misma sensibilidad. Si fuese necesario, se diluirá la solución anterior con n-heptano en la relación necesaria para poder ajustarse a las prescripciones fijadas. Efectuar, cuando menos, tres determinaciones consecutivas, que no deben discrepar entre sí mas del 1%.
4.Análisis cuantitativo de la totalidad de los componentes de la fracción de ácidos grasos, comprendiendo el C4 al C20 y el C18:3
4.1.Preparación de la mezcla de calibración: Determinar previamente el factor de corrección para cada ácido componente de la mezcla, referido a uno cualquiera de ellos que se toma como patrón, eligiéndose normalmente para este fin el ácido palmítico y, debiendo tener la mezcla de calibración una composición análoga a la de la mezcla problema. Para ello, si no se conoce previamente el orden de composición del problema, se realizará una determinación cromatográfica de orientación, en el registro se hará la cuantificación de los componentes, con el mismo factor de respuesta para todos ellos, efectuando un reparto proporcional entre las áreas medidas. En un matraz aforado de 50 ml, pesar, con una exactitud de ±0,1 mg, las cantidades de los ésteres metílicos patrones que se indican a continuación proporcionales a las cifras de composición encontradas en el análisis de orientación anteriormente aludido, o previstas con anterioridad para la muestra. Los patrones que deben pasarse son los siguientes: metilo butanoato, metilo hexanoato, metilo octanoato, metilo decanoato, metilo dodecanoato, metilo tetradecanoato, metilo hexadecanoato, metilo octadecanoato, metilo oleato, metilo linoleato y metilo eicosanato. Se disuelve la mezcla de n-heptano agregando la cantidad adecuada de disolvente en relación al peso total de ésteres metílicos que se hayan pesado; para unos 50 ml de n-heptano (PA). A continuación inyectar 0,2-0,4µl para que, trabajando a la sensibilidad media del aparato, se consiga situar el máximo del pico correspondiente al componente mayoritario, en una posición del 70-80% del recorrido total de la pluma del registrador. Todos los picos deben registrarse a la misma sensibilidad, lo cual suele ser perfectamente factible en la grasa de leche; en aquellos casos en que la relación entre el pico mayoritario y el pico minoritario no permita registrar este último con las dimensiones adecuadas para efectuar una cuantificación correcta de su área, se podrá efectuar el cambio necesario en la atenuación del registro, procurando que éste no sobrepase la relación de 4:1. Si fuese necesario, se diluirá la solución con n-heptano en la relación necesaria para poder ajustarse a las prescripciones fijadas. Efectuar, cuando menos, tres determinaciones consecutivas, que no deben discrepar entre sí más del 1%.
Expresión de los resultados.
Los distintos resultados se obtienen mediante las siguientes fórmulas:
1-Cálculo de los factores de corrección para los ácidos butírico y caproico: Se determinan las áreas de los tres picos, siguiendo las normas que se contienen en el apartado ya descrito en la técnica de cromatografía de gases de esteroles, y se calculan los dos factores correspondientes al C4 y C6, del modo siguiente:
fx = x. Ap/ P. Ax
teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
f x = factor de corrección del componente ácido x.
x = cantidad pesada del ácido x.
Ap = área medida en el registro para el patrón del pentanoato.
Ax = área medida en el registro para el ácido x.
P = peso del patrón pentanoato.
Principios y fundamentos metodológicos.
El fundamento del método es la obtención de los ésteres metílicos de los ácidos grasos mediante la reacción con una solución de potasio hidróxido en alcohol metílico y la consiguiente inyección de la disolución de los ésteres metílicos directamente en el cromatógrafo. Este método es aplicable a las grasas de mantequillas u otras que contengan ácidos grasos de longitud de cadena inferior al C14 y siempre que el contenido en ácidos libres no exceda de 1% expresados en ácido oleico.
Material y aparatos utilizados.
-Matraces con boca esmerilada y fondo redondo de 50 y 100 ml de capacidad.
-Pipetas aforadas de 1, 2 y 10 ml.
-Matraces aforados de 50 y 100 ml de capacidad.
-Probeta graduada de 10 ml.
-Jeringa de características adecuadas para la inyección de la muestra, graduada en décimas de ml, con una capacidad total de 1 a 10 ml.
-Cromatógrafo apto para trabajar en fase gaseosa, provisto de horno capaz de ser calentado hasta 250-300 ºC y sistema de regulación que permita controlar la temperatura con un error de ± 1,0 ºC. Equipado con programador de temperatura capaz de llevar la temperatura del horno de 60 ºC a 180 ºC a una velocidad de 4 ºC/minuto, y provisto de regulación independiente de la temperatura del inyector, que podrá ser calentado a una temperatura superior al menos en 50 ºC a la máxima alcanzable por el horno provisto de un sistema de detección sensible, de ionización de llama de hidrógeno, que pueda ser mantenido a la temperatura de la columna, a unos 50 ºC por encima de la del horno.
-Registrador con una tensión de entrada adecuada a la salida del amplificador del cromatógrafo, con una velocidad de respuesta mínima capaz de producir la deflexión completa de la escala en un segundo; y una velocidad de desplazamiento del papel de 5mm/min, que permita la posibilidad de variar esta velocidad, acelerando o retardando el desplazamiento.
-Tubo de nitrógeno a presión, utilizable como gas portador, debiendo tener una riqueza mínima del 99,8%.
-Tubos de hidrógeno y aire a presión necesarios para el caso en que se utilice detector de llama de hidrógeno. El hidrógeno deberá tener una riqueza mínima del 99,8%, debiendo además estar seco. Como medida de seguridad, es muy conveniente colocar a la entrada de los gases en el cromatógrafo, sendos tubos de desecación, provistos de tamiz molecular 13X.
-Columna cromatográfica:
1.Columna que satisfaga las condiciones que se indican en las observaciones (punto 1).
2.Columna de vidrio con diámetro interior de 4 mm y una longitud aproximada de 2 mm. Rellenada con Chromosorb G, W o Q (80-100 mallas), conteniendo de 2,5 a 5% de un poliéster; pudiendo utilizarse cualquiera de los tres siguientes: dietilenglicolsuccinato (DEGS), etilenglicolsuccinato (EGS) o etilenglicoladipato (EGA), y polietilenglicoladipato (PEGA).
Antes de emplear una columna nueva en la resolución de problemas analíticos, debe ser acondicionada, eliminando todos aquellos productos volátiles que pertubarían la buena marcha de la cromatografía. Para ello, la columna se monta en el cromatógrafo, sin conectarla al detector, y se calienta el horno a unos 10 ºC por encima de la temperatura máxima a que vaya a ser utilizada dicha columna en trabajos posteriores; haciendo pasar al mismo tiempo, una corriente de nitrógeno de 30 a 40 ml/minuto, que se mantiene durante 24 horas como mínimo. La columna será apta para su utilización si, una vez conectada al detector y en funcionamiento normal, la línea base dibujada por el registrador acusa la estabilidad del sistema.
Reactivos necesarios.
-Alcohol metílico (PA).
-Éter de petróleo de 40-60 ºC (PA).
-n-heptano (PA).
-Potasio hidróxido al 85% en lentejas (PA).
El éter de petróleo n-hexano deben tener un contenido en benceno no superior a 0,1%, además de cumplir el resto de las especificaciones en ambos reactivos.
En la preparación de la disolución de potasio hidróxido 2 N en alcohol metílico se disuelven 11,2 g de potasio hidróxido al 85% en lentejas (PA) en 100 ml de alcohol metílico.
Los éteres metílicos deben tener la pureza adecuada para poder ser utilizados como patrones en cromatografía gaseosa. Para ello, se dispondrá de los ésteres metílicos de los ácidos mencionados a continuación, debiendo tener una pureza mínima de 99%, determinada por cromatografía gaseosa:
Ácido butanoico (butírico).
Ácido pentanoico (valeriánico).
Ácido hexanoico (caproico).
Ácido octanoico (caprílico).
Ácido decanoico (cáprico).
Ácido dodecanoico (laúrico).
Ácido tetradecanoico (mirístico).
Ácido hexadecanoico (palmítico).
Ácido octadecanoico (esteárico).
Ácido 9-octadecanoico (oleico).
Ácido 9,12-octadecadienoico (linoléico).
Ácido sicosanoico (aráquico).
La solución de referencia I se prepara en un matraz aforado de 50 ml donde se pesa 1 g de metilo pentanoato, con una exactitud de ±0,1 mg, disolviéndolo en n-heptano (PA), y completando hasta el volumen de enrase.
La solución de Referencia II se prepara en un matraz aforado de 100 ml donde se pesan 200 g de metilo pentanoato, con una exactitud de ±0,1 mg, disolviéndolo en n-heptano (PA), y completando hasta el volumen de enrase.
Procedimiento analítico.
1.Preparación de los ésteres metílicos: En un matraz de fondo redondo de 50 ml, pesar 1 g de grasa, con exactitud de ±0,1 mg, añadiendo 10 ml de éter de petróleo 40-60 ºC (PRS) o n-hexano (PA), y agitar suavemente hasta disolución de la grasa. En el caso de que se quiera efectuar una determinación cuantitativa de los ácidos butírico y caproico en la muestra, hay que agregar a la disolución en éter de petróleo de la grasa, 1 ml de la solución de referencia más adecuada, medida exactamente. En el caso de que las muestras contengan de 1 a 4% de ácido butírico se utilizará la solución de referencia I; en cambio, si contienen menos de 1% de ácido butírico se emplea la solución de referencia II. Si se desea efectuar solamente un análisis completo de la fracción de ácidos grasos, para lo que se aplica el método de normalización interna, no será necesario el empleo de la solución de referencia. A la solución en éter de petróleo de la muestra, adicionada o no de solución de referencia, se debe agregar 0,5 ml de disolución de potasio hidróxido 2 N, agitando la muestra hasta que se ponga transparente, durante un tiempo aproximado de 20-30 segundos. Casi inmediatamente después de observar la clarificación de la solución suele apreciarse un ligero enturbiamiento debido a la separación de glicerol, que se sedimenta rápidamente. Nada más terminada la reacción y observada la sedimentación, hay que tomar la cantidad necesaria con la jeringa e inyectarla en el cromatógrafo; una demora en la inyección de los ésteres metílicos daría lugar a la formación de jabones, con el consiguiente error en la determinación analítica.
2.Determinación cromatográfica:
2.1.Condiciones de trabajo:
-Temperatura de la columna: Temperatura programada de 60 a 160 ºC con una velocidad de 4 ºC/minuto.
-Temperatura del inyector: 200 ºC.
-Temperatura del detector: 200 ºC.
-Gas Portador: Nitrógeno (o helio) con flujo de 60 ml/min.
-Flujo de hidrógeno y aire para la alimentación del detector: Los flujos dependerán del tipo de detector utilizado, debiendo determinarse previamente para optimizar la respuesta.
-El registro obtenido del cromatograma: Debe satisfacer las condiciones establecidas a continuación; en caso contrario, se debe repetir la inyección modificando la cantidad inyectada o la sensibilidad de trabajo hasta obtener un cromatograma satisfactorio.
Los requisitos exigibles son los siguientes:
a) El área total descrita en el registro, referida a la sensibilidad máxima utilizada en el curso de la operación, debe ser aproximadamente de 2.000 mm2 con una velocidad del papel en el registrador de 5mm/minuto. De esta forma, los componentes presentes en una cuantía de 0,1% deben dar un pico, como mínimo de 2 mm2 , siendo, por tanto perfectamente reconocibles.
b) Con el fin de conseguir que todos los picos caigan dentro del papel registrador, se utilizará, en cada caso, la atenuación de sensibilidad que sea necesaria, cuidando que el pico de mayor intensidad no sea atenuado más de ocho veces. Una vez conseguido un registro satisfactorio, y habiendo alcanzado nuevamente la pluma la línea base, se interrumpe el funcionamiento del registrador y se retira el papel con el registro para la identificación de los picos y/o cálculos cuantitativos.
2.2.Identificación de los picos. Se seguirán los criterios establecidos en el apartado de observaciones (punto 2).
2.3.Determinaciones cuantitativas: La determinación cuantitativa se basa en el principio de que los pesos de cada uno de los componentes separados en la mezcla son proporcionales a las áreas comprendidas dentro de los triángulos dibujados debajo de cada pico. El área de cada triángulo se obtiene trazando rectas tangentes a las líneas dibujadas en el registro, prolongándolas hasta su intersección con la línea base y multiplicando la altura del triángulo por la mitad de la base. En el caso de haber trabajado con atenuaciones diferentes para cada pico, se referirán todas las medidas a una misma sensibilidad del registrador, multiplicando la altura por el factor de atenuación correspondiente en cada caso, y el valor de la altura así corregida por la mitad de la base.
3.Determinación del contenido de los ácidos butírico y caproico en la materia grasa: Esta determinación se realiza por el método del patrón interno, siendo el patrón elegido el metilo pentanoato.
3.1.Preparación de la mezcla de calibración: Con una exactitud de ±0,1 mg y en un matraz aforado de 50 ml, pesar unos 100 mg de cada uno de los siguientes patrones: metilo butanoato, metilo pentanoato y metilo caproato. Se disuelve la mezcla de n-heptano y se diluye completando hasta el volumen de enrase. Inyectar la cantidad necesaria de la solución anterior, normalmente 0,2-0,4 µl, para que, trabajando a la sensibilidad media del aparato, se consiga situar los máximos de los picos en una posición del 70-80% del recorrido total de la pluma del registrador. Los tres picos deberán registrarse a la misma sensibilidad. Si fuese necesario, se diluirá la solución anterior con n-heptano en la relación necesaria para poder ajustarse a las prescripciones fijadas. Efectuar, cuando menos, tres determinaciones consecutivas, que no deben discrepar entre sí mas del 1%.
4.Análisis cuantitativo de la totalidad de los componentes de la fracción de ácidos grasos, comprendiendo el C4 al C20 y el C18:3
4.1.Preparación de la mezcla de calibración: Determinar previamente el factor de corrección para cada ácido componente de la mezcla, referido a uno cualquiera de ellos que se toma como patrón, eligiéndose normalmente para este fin el ácido palmítico y, debiendo tener la mezcla de calibración una composición análoga a la de la mezcla problema. Para ello, si no se conoce previamente el orden de composición del problema, se realizará una determinación cromatográfica de orientación, en el registro se hará la cuantificación de los componentes, con el mismo factor de respuesta para todos ellos, efectuando un reparto proporcional entre las áreas medidas. En un matraz aforado de 50 ml, pesar, con una exactitud de ±0,1 mg, las cantidades de los ésteres metílicos patrones que se indican a continuación proporcionales a las cifras de composición encontradas en el análisis de orientación anteriormente aludido, o previstas con anterioridad para la muestra. Los patrones que deben pasarse son los siguientes: metilo butanoato, metilo hexanoato, metilo octanoato, metilo decanoato, metilo dodecanoato, metilo tetradecanoato, metilo hexadecanoato, metilo octadecanoato, metilo oleato, metilo linoleato y metilo eicosanato. Se disuelve la mezcla de n-heptano agregando la cantidad adecuada de disolvente en relación al peso total de ésteres metílicos que se hayan pesado; para unos 50 ml de n-heptano (PA). A continuación inyectar 0,2-0,4µl para que, trabajando a la sensibilidad media del aparato, se consiga situar el máximo del pico correspondiente al componente mayoritario, en una posición del 70-80% del recorrido total de la pluma del registrador. Todos los picos deben registrarse a la misma sensibilidad, lo cual suele ser perfectamente factible en la grasa de leche; en aquellos casos en que la relación entre el pico mayoritario y el pico minoritario no permita registrar este último con las dimensiones adecuadas para efectuar una cuantificación correcta de su área, se podrá efectuar el cambio necesario en la atenuación del registro, procurando que éste no sobrepase la relación de 4:1. Si fuese necesario, se diluirá la solución con n-heptano en la relación necesaria para poder ajustarse a las prescripciones fijadas. Efectuar, cuando menos, tres determinaciones consecutivas, que no deben discrepar entre sí más del 1%.
Expresión de los resultados.
Los distintos resultados se obtienen mediante las siguientes fórmulas:
1-Cálculo de los factores de corrección para los ácidos butírico y caproico: Se determinan las áreas de los tres picos, siguiendo las normas que se contienen en el apartado ya descrito en la técnica de cromatografía de gases de esteroles, y se calculan los dos factores correspondientes al C4 y C6, del modo siguiente:
fx = x. Ap/ P. Ax
teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
f x = factor de corrección del componente ácido x.
x = cantidad pesada del ácido x.
Ap = área medida en el registro para el patrón del pentanoato.
Ax = área medida en el registro para el ácido x.
P = peso del patrón pentanoato.
2-Cálculo del contenido de ácidos: Los contenidos de ácido butírico y ácido caproico en la muestra de grasa de la mantequilla se calculan mediante la siguiente fórmula:
Contenido de ácidos (en %) = 100. f x Ax P / Ap M
teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
f x = factor de corrección determinado para cada ácido, según lo indicado en el apartado anterior.
Ax = área medida en el registro para el ácido x.
P = peso del patrón interno (pentanoato).
Ap = área medida en el registro para el patrón interno.
M = peso de la muestra de grasa.
3-Cálculo de los factores de corrección: Una vez determinadas las áreas de todos los picos, siguiendo las normas descritas en el procedimiento analítico, se calcula el factor de corrección de cada ácido, referido al ácido palmítico, como unidad de referencia, empleando la fórmula incluida en este apartado (punto 1), para lo que se sustituye el área Ap y el peso P del compuesto patrón por los valores correspondientes al metilo palmitato.
4-Cálculo de la composición de la fracción de ácidos grasos: Se calcularán las áreas corregidas de cada uno de los componentes de la fracción multiplicando el área medida en el registro por el factor de corrección determinado según lo indicado en el apartado anterior (punto 3). El contenido de cada componente se calcula mediante la siguiente fórmula:
Fracción de ácidos grasos (en %) = X = 100. f x Ax / Σ(fx . Ax)
teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
f x = factor de corrección del componente x.
Ax = área medida en el registro para el componente x.
Σ(fx . Ax) = suma de todas las áreas corregidas correspondientes a los componentes de la fracción.
9.6. Observaciones:
1.La puesta a punto de la columna se determina obteniendo la resolución de dos productos críticos como son el metilo oleato y el estearato. La resolución viene determinada por la siguiente expresión:
Resolución = 2 D/ O + E
siendo:
D = distancia entre los dos máximos de los picos del oleato y el estearato.
O = ancho de la base del pico correspondiente al oleato.
E = ancho de la base del pico correspondiente al estearato.
Estos valores se determinan sobre el cromatograma obtenido con una muestra conteniendo cantidades aproximadamente iguales de metilo estearato y oleato, inyectando una cantidad tal que la altura de estos picos alcance al 25-50% del ancho del papel de registro. Si la resolución calculada es igual o mayor que 1,0 la columna y el instrumento se encuentran en condiciones satisfactorias. Todas las columnas en el transcurso de su utilización sufren una pérdida gradual en la resolución de los picos; cuando el valor llegue a ser inferior a 1,0 deberá instalarse una nueva columna.
2.Para la identificación de los picos se pueden seguir los dos criterios siguientes:
2.1.Criterio basado en los tiempos de retención: Refiriéndose exclusivamente a los ácidos que entran normalmente en la composición de las grasas naturales, sus ésteres aparecen en el cromatograma en orden creciente de sus átomos de carbono y a su insaturación. Esto significa que el palmítico (C16) aparece delante del esteárico (C18), y los ésteres en C18 aparecen en el orden estearato, oleato, linoleato y linolenato. El éster del ácido aráquico (C20:0), usualmente, aparecen antes del linoléico (C18:3), pero en algunos casos puede ocurrir lo contrario, dependiendo del tipo de columna y de las condiciones de su utilización, o incluso superponerse uno al otro. Operando en condiciones constantes, los tiempos de retención son reproducibles en cada especie química, siendo el criterio más frecuente empleado para su identificación. El tiempo de retención viene dado por la distancia, medida en el cromatograma, entre el máximo del pico del aire y la posición del máximo de la banda. Trabajando con detector de llama de hidrógeno, la salida del aire no se detecta, pudiéndose escoger, en este caso, el momento en que se inicia la salida del disolvente, acusada por una fuerte deflexión de la pluma del registrador.
2.2.Criterio basado en los tiempos de retención relativos: Los tiempos de retención relativos son más reproducibles. Las retenciones relativas vienen determinadas por el cociente de dividir el tiempo de retención de cada pico por el tiempo registrado para el pico del metilo palmitato, o bien por otro éster que se tome como comparación, determinados todos ellos según el criterio expuesto en el párrafo anterior.
Referencias.
-Métodos de análisis. Boletín Oficial del Estado (21/7/1977 y 22/7/1977).
-Instituto de Racionalización y Normalización del Trabajo. Una Norma Española 55.118.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.
-Instituto de Racionalización y Normalización del Trabajo. Una Norma Española 55.118.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.
José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)
