Continuando con las técnicas de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación de los ácidos grasos de cadena corta en la mantequilla.
Principios y fundamentos metodológicos.
El fundamento del método es la obtención
de los ésteres metílicos de los ácidos grasos mediante la reacción con una solución de potasio hidróxido en alcohol metílico y la consiguiente inyección de la disolución de los ésteres metílicos directamente en el cromatógrafo. Este método es aplicable a las grasas de mantequillas u otras que
contengan ácidos grasos de longitud de cadena inferior al C14 y siempre que el contenido en ácidos libres no exceda de 1%
expresados en ácido oleico.
Material y aparatos utilizados.
-Matraces con boca
esmerilada y fondo redondo de 50 y 100 ml de capacidad.
-Pipetas aforadas de 1, 2 y
10 ml.
-Matraces aforados de 50 y
100 ml de capacidad.
-Probeta graduada de 10 ml.
-Jeringa de características
adecuadas para la inyección de la muestra, graduada en décimas de
ml, con una capacidad total de 1 a 10 ml.
-Cromatógrafo apto para
trabajar en fase gaseosa, provisto de horno capaz de ser calentado
hasta 250-300 ºC y sistema de regulación que permita controlar la
temperatura con un error de ± 1,0 ºC. Equipado con programador de
temperatura capaz de llevar la temperatura del horno de 60 ºC a 180 ºC
a una velocidad de 4 ºC/minuto, y provisto de regulación independiente de
la temperatura del inyector, que podrá ser calentado a una
temperatura superior al menos en 50 ºC a la máxima alcanzable por
el horno provisto de un sistema de detección sensible, de ionización
de llama de hidrógeno, que pueda ser mantenido a la temperatura de
la columna, a unos 50 ºC por encima de la del horno.
-Registrador con una
tensión de entrada adecuada a la salida del amplificador del
cromatógrafo, con una velocidad de respuesta mínima capaz de
producir la deflexión completa de la escala en un segundo; y una
velocidad de desplazamiento del papel de 5mm/min, que permita la
posibilidad de variar esta velocidad, acelerando o retardando el
desplazamiento.
-Tubo de nitrógeno a
presión, utilizable como gas portador, debiendo tener una riqueza
mínima del 99,8%.
-Tubos de hidrógeno y aire
a presión necesarios para el caso en que se utilice detector de
llama de hidrógeno. El hidrógeno deberá tener una riqueza mínima
del 99,8%, debiendo además estar seco. Como medida de seguridad, es muy
conveniente colocar a la entrada de los gases en el cromatógrafo,
sendos tubos de desecación, provistos de tamiz molecular 13X.
-Columna cromatográfica:
1.Columna que satisfaga
las condiciones que se indican en las observaciones (punto 1).
2.Columna de vidrio con
diámetro interior de 4 mm y una longitud aproximada de 2 mm.
Rellenada con Chromosorb G, W o Q (80-100 mallas), conteniendo de 2,5
a 5% de un poliéster; pudiendo utilizarse cualquiera de los tres siguientes: dietilenglicolsuccinato (DEGS), etilenglicolsuccinato (EGS) o etilenglicoladipato (EGA), y polietilenglicoladipato (PEGA).
Antes de emplear una columna
nueva en la resolución de problemas analíticos, debe ser
acondicionada, eliminando todos aquellos productos volátiles que
pertubarían la buena marcha de la cromatografía. Para ello, la columna se monta en
el cromatógrafo, sin conectarla al detector, y se calienta el horno
a unos 10 ºC por encima de la temperatura máxima a que vaya a ser
utilizada dicha columna en trabajos posteriores; haciendo pasar al mismo
tiempo, una corriente de nitrógeno de 30 a 40 ml/minuto, que se
mantiene durante 24 horas como mínimo. La columna será
apta para su utilización si, una vez conectada al detector y en
funcionamiento normal, la línea base dibujada por el registrador
acusa la estabilidad del sistema.
Reactivos necesarios.
-Alcohol metílico (PA).
-Éter de petróleo de 40-60 ºC (PA).
-n-heptano (PA).
-Potasio hidróxido al 85% en lentejas (PA).
El éter de petróleo n-hexano deben tener un contenido en benceno no superior a 0,1%, además de cumplir el resto de las especificaciones en ambos reactivos.
En la preparación de la disolución de potasio hidróxido 2 N en alcohol metílico se disuelven 11,2 g de potasio hidróxido al 85% en lentejas (PA) en 100 ml de alcohol metílico.
Los éteres metílicos deben tener la pureza adecuada para poder ser utilizados como patrones en cromatografía gaseosa. Para ello, se dispondrá de los ésteres metílicos de los ácidos
mencionados a continuación, debiendo tener una pureza mínima de 99%,
determinada por cromatografía gaseosa:
Ácido
butanoico (butírico).
Ácido
pentanoico (valeriánico).
Ácido
hexanoico (caproico).
Ácido
octanoico (caprílico).
Ácido
decanoico (cáprico).
Ácido
dodecanoico (laúrico).
Ácido
tetradecanoico (mirístico).
Ácido
hexadecanoico (palmítico).
Ácido
octadecanoico (esteárico).
Ácido
9-octadecanoico (oleico).
Ácido
9,12-octadecadienoico (linoléico).
Ácido
sicosanoico (aráquico).
La solución de referencia I se prepara en un matraz aforado de 50 ml donde se pesa 1 g de metilo pentanoato, con una exactitud de ±0,1 mg, disolviéndolo en n-heptano (PA), y completando
hasta el volumen de enrase.
La solución de Referencia
II se prepara en un matraz aforado de 100 ml donde se pesan 200 g de metilo pentanoato, con una exactitud de ±0,1
mg, disolviéndolo en n-heptano (PA), y
completando hasta el volumen de enrase.
Procedimiento analítico.
1.Preparación de los
ésteres metílicos: En un matraz de fondo redondo de
50 ml, pesar 1 g de grasa, con exactitud de ±0,1 mg, añadiendo 10 ml de éter de petróleo 40-60 ºC (PRS) o n-hexano (PA), y agitar suavemente
hasta disolución de la grasa. En el caso de que se quiera
efectuar una determinación cuantitativa de los ácidos butírico y caproico en la muestra, hay que agregar a la disolución en éter de petróleo
de la grasa, 1 ml de la solución de referencia
más adecuada, medida exactamente. En el caso de que las muestras contengan de 1 a 4% de ácido butírico se utilizará la solución de referencia I; en cambio, si contienen menos de 1% de ácido butírico se emplea la solución
de referencia II. Si se desea efectuar solamente un
análisis completo de la fracción de ácidos grasos, para lo que se
aplica el método de normalización interna, no será necesario el
empleo de la solución de referencia. A la solución en éter de petróleo de la muestra, adicionada o no de solución de referencia, se debe agregar 0,5 ml de disolución de potasio hidróxido 2 N, agitando la muestra hasta que se ponga transparente, durante un tiempo aproximado de 20-30 segundos. Casi inmediatamente después de observar la clarificación de la solución suele
apreciarse un ligero enturbiamiento debido a la separación de glicerol, que
se sedimenta rápidamente. Nada más terminada la reacción y observada la sedimentación, hay que tomar la
cantidad necesaria con la jeringa e inyectarla en el cromatógrafo; una
demora en la inyección de los ésteres metílicos daría lugar a la
formación de jabones, con el consiguiente error en la determinación analítica.
2.Determinación
cromatográfica:
2.1.Condiciones de trabajo:
-Temperatura de la columna: Temperatura programada de 60 a 160 ºC con una velocidad de 4 ºC/minuto.
-Temperatura del inyector: 200 ºC.
-Temperatura del detector: 200 ºC.
-Gas Portador: Nitrógeno (o
helio) con flujo de 60 ml/min.
-Flujo de hidrógeno y aire para
la alimentación del detector: Los flujos dependerán del tipo de
detector utilizado, debiendo determinarse previamente para optimizar
la respuesta.
-El registro obtenido del
cromatograma: Debe satisfacer las condiciones establecidas a continuación; en caso contrario, se debe repetir la inyección modificando la
cantidad inyectada o la sensibilidad de trabajo hasta obtener un
cromatograma satisfactorio.
Los requisitos exigibles son los
siguientes:
a) El área total descrita en el
registro, referida a la sensibilidad máxima utilizada en el curso de
la operación, debe ser aproximadamente de 2.000 mm2 con una velocidad del papel en el registrador de 5mm/minuto. De esta
forma, los componentes presentes en una cuantía de 0,1% deben dar un
pico, como mínimo de 2 mm2 , siendo, por tanto perfectamente
reconocibles.
b) Con el fin de conseguir que
todos los picos caigan dentro del papel registrador, se utilizará,
en cada caso, la atenuación de sensibilidad que sea necesaria, cuidando que el pico de mayor intensidad no sea atenuado más de ocho
veces. Una vez conseguido un registro
satisfactorio, y habiendo alcanzado nuevamente la pluma la línea
base, se interrumpe el funcionamiento del registrador y se retira el
papel con el registro para la identificación de los picos y/o
cálculos cuantitativos.
2.2.Identificación de los
picos. Se seguirán los criterios establecidos en el apartado de observaciones (punto 2).
2.3.Determinaciones
cuantitativas: La determinación cuantitativa se basa en el principio
de que los pesos de cada uno de los componentes separados en la
mezcla son proporcionales a las áreas comprendidas dentro de los
triángulos dibujados debajo de cada pico. El área de cada triángulo
se obtiene trazando rectas tangentes a las líneas dibujadas en el
registro, prolongándolas hasta su intersección con la línea base y
multiplicando la altura del triángulo por la mitad de la base. En el
caso de haber trabajado con atenuaciones diferentes para cada pico,
se referirán todas las medidas a una misma sensibilidad del
registrador, multiplicando la altura por el factor de atenuación correspondiente en cada caso, y el valor de la altura así corregida
por la mitad de la base.
3.Determinación del
contenido de los ácidos butírico y caproico en la materia grasa: Esta determinación se realiza por el método del patrón interno,
siendo el patrón elegido el metilo pentanoato.
3.1.Preparación de la
mezcla de calibración: Con una exactitud de ±0,1 mg y en un matraz
aforado de 50 ml, pesar unos 100 mg de cada uno de los siguientes
patrones: metilo butanoato, metilo pentanoato y metilo caproato. Se
disuelve la mezcla de n-heptano y se diluye completando hasta el volumen de enrase. Inyectar la cantidad necesaria de
la solución anterior, normalmente 0,2-0,4 µl, para que, trabajando a la sensibilidad media del aparato, se
consiga situar los máximos de los picos en una posición del 70-80%
del recorrido total de la pluma del registrador. Los tres picos
deberán registrarse a la misma sensibilidad. Si fuese necesario, se
diluirá la solución anterior con n-heptano en la relación
necesaria para poder ajustarse a las prescripciones fijadas.
Efectuar, cuando menos, tres determinaciones consecutivas, que no
deben discrepar entre sí mas del 1%.
4.Análisis cuantitativo de
la totalidad de los componentes de la fracción de ácidos grasos,
comprendiendo el C4 al C20 y el C18:3
4.1.Preparación de la
mezcla de calibración: Determinar previamente el factor de
corrección para cada ácido componente de la mezcla, referido a uno
cualquiera de ellos que se toma como patrón, eligiéndose normalmente para este fin el ácido palmítico y, debiendo tener la
mezcla de calibración una composición análoga a la de la mezcla
problema. Para ello, si no se conoce
previamente el orden de composición del problema, se realizará una
determinación cromatográfica de orientación, en el
registro se hará la cuantificación de los componentes, con el mismo
factor de respuesta para todos ellos, efectuando un reparto
proporcional entre las áreas medidas. En un matraz aforado de 50 ml,
pesar, con una exactitud de ±0,1 mg, las cantidades de los ésteres
metílicos patrones que se indican a continuación proporcionales a
las cifras de composición encontradas en el análisis de orientación
anteriormente aludido, o previstas con anterioridad para la muestra.
Los patrones que deben pasarse son los siguientes: metilo butanoato,
metilo hexanoato, metilo octanoato, metilo decanoato, metilo
dodecanoato, metilo tetradecanoato, metilo hexadecanoato, metilo
octadecanoato, metilo oleato, metilo linoleato y metilo eicosanato.
Se disuelve la mezcla de n-heptano agregando la cantidad adecuada de
disolvente en relación al peso total de ésteres metílicos que se
hayan pesado; para unos 50 ml de n-heptano (PA). A continuación
inyectar 0,2-0,4µl para que, trabajando a la sensibilidad media del
aparato, se consiga situar el máximo del pico correspondiente al
componente mayoritario, en una posición del 70-80% del recorrido
total de la pluma del registrador. Todos los picos deben registrarse
a la misma sensibilidad, lo cual suele ser perfectamente factible
en la grasa de leche; en aquellos casos en que la relación entre el
pico mayoritario y el pico minoritario no permita registrar este
último con las dimensiones adecuadas para efectuar una
cuantificación correcta de su área, se podrá efectuar el cambio
necesario en la atenuación del registro, procurando que éste no
sobrepase la relación de 4:1. Si fuese necesario, se diluirá la
solución con n-heptano en la relación necesaria para poder
ajustarse a las prescripciones fijadas. Efectuar, cuando menos, tres
determinaciones consecutivas, que no deben discrepar entre sí más
del 1%.
Expresión de los resultados.
Los distintos resultados se obtienen mediante las siguientes fórmulas:
1-Cálculo de los factores
de corrección para los ácidos butírico y caproico: Se determinan
las áreas de los tres picos, siguiendo las normas que se contienen
en el apartado ya descrito en la técnica de cromatografía de gases de esteroles, y se calculan los dos factores correspondientes
al C4 y C6, del modo siguiente:
fx
= x. Ap/ P. Ax
teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
f
x = factor de corrección del componente ácido x.
x = cantidad pesada del ácido x.
Ap = área medida en el registro para el patrón del pentanoato.
Ax
= área medida en el registro para el ácido x.
P = peso del patrón pentanoato.
2-Cálculo del contenido de ácidos: Los contenidos de ácido butírico y ácido caproico en la muestra de grasa de la mantequilla se calculan mediante la siguiente fórmula:
Contenido de ácidos (en %) = 100. f x Ax P / Ap M
teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
f x = factor de corrección determinado para cada ácido, según lo indicado en el apartado anterior.
Ax = área medida en el registro para el ácido x.
P = peso del patrón interno (pentanoato).
Ap = área medida en el registro para el patrón interno.
M = peso de la muestra de grasa.
3-Cálculo de los factores de corrección: Una vez determinadas las áreas de todos los picos, siguiendo las normas descritas en el procedimiento analítico, se calcula el factor de corrección de cada ácido, referido al ácido palmítico, como unidad de referencia, empleando la fórmula incluida en este apartado (punto 1), para lo que se sustituye el área Ap y el peso P del compuesto patrón por los valores correspondientes al metilo palmitato.
4-Cálculo de la composición de la fracción de ácidos grasos: Se calcularán las áreas corregidas de cada uno de los componentes de la fracción multiplicando el área medida en el registro por el factor de corrección determinado según lo indicado en el apartado anterior (punto 3). El contenido de cada componente se calcula mediante la siguiente fórmula:
Fracción de ácidos grasos (en %) = X = 100. f x Ax / Σ(fx . Ax)
teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
f x = factor de corrección del componente x.
Ax = área medida en el registro para el componente x.
Σ(fx . Ax) = suma de todas las áreas corregidas correspondientes a los componentes de la fracción.
9.6. Observaciones:
1.La puesta a punto de la
columna se determina obteniendo la resolución de dos productos
críticos como son el metilo oleato y el estearato. La resolución
viene determinada por la siguiente expresión:
Resolución = 2 D/ O + E
siendo:
D =
distancia entre los dos máximos de los picos del oleato y el
estearato.
O = ancho de la base del pico correspondiente al oleato.
E
= ancho de la base del pico correspondiente al estearato.
Estos valores se determinan sobre
el cromatograma obtenido con una muestra conteniendo cantidades
aproximadamente iguales de metilo estearato y oleato, inyectando una
cantidad tal que la altura de estos picos alcance al 25-50% del ancho
del papel de registro. Si la resolución calculada es igual o mayor
que 1,0 la columna y el instrumento se encuentran en condiciones
satisfactorias. Todas las columnas en el transcurso de su utilización
sufren una pérdida gradual en la resolución de los picos; cuando el
valor llegue a ser inferior a 1,0 deberá instalarse una nueva
columna.
2.Para la identificación de
los picos se pueden seguir los dos criterios siguientes:
2.1.Criterio basado en los
tiempos de retención: Refiriéndose exclusivamente a los ácidos que
entran normalmente en la composición de las grasas naturales, sus
ésteres aparecen en el cromatograma en orden creciente de sus átomos
de carbono y a su insaturación. Esto significa que el palmítico (C16)
aparece delante del esteárico (C18), y los ésteres en
C18 aparecen en el orden estearato, oleato, linoleato y
linolenato. El éster del ácido aráquico (C20:0),
usualmente, aparecen antes del linoléico (C18:3),
pero en algunos casos puede ocurrir lo contrario, dependiendo del
tipo de columna y de las condiciones de su utilización, o incluso
superponerse uno al otro. Operando en condiciones
constantes, los tiempos de retención son reproducibles en cada
especie química, siendo el criterio más frecuente empleado para su
identificación. El tiempo de retención viene
dado por la distancia, medida en el cromatograma, entre el máximo
del pico del aire y la posición del máximo de la banda. Trabajando
con detector de llama de hidrógeno, la salida del aire no se
detecta, pudiéndose escoger, en este caso, el momento en que se
inicia la salida del disolvente, acusada por una fuerte deflexión de
la pluma del registrador.
2.2.Criterio basado en los
tiempos de retención relativos: Los tiempos de retención relativos
son más reproducibles. Las retenciones relativas vienen
determinadas por el cociente de dividir el tiempo de retención de
cada pico por el tiempo registrado para el pico del metilo palmitato,
o bien por otro éster que se tome como comparación, determinados
todos ellos según el criterio expuesto en el párrafo anterior.
Referencias.
-Métodos de análisis. Boletín Oficial del Estado (21/7/1977 y 22/7/1977).
-Instituto de Racionalización y Normalización del Trabajo. Una Norma Española 55.118.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.
José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)
