LABORATORIO: GRASA DE LA LECHE-3

Continuando con los métodos oficiales de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica de la materia grasa en leches concentrada, evaporada y condensada.

Principios y fundamentos metodológicos.
Este método es aplicable a las leches concentrada, evaporada y condensada, enteras o desnatadas, definidas en el Reglamento de Centrales Lecheras y otras Industrias Lácteas. En este sentido, se entiende por contenido en materia grasa de las leches concentrada, evaporada y condensada, el porcentaje en masa de las sustancias determinadas por el procedimiento expuesto a continuación, que corresponde al descrito en la norma FIL-13A: 1969 de la Federación Internacional de Lechería (FIL). El contenido en materia grasa se determina gravimétricamente por extracción de la citada materia grasa en una solución alcohólico-amoniacal del tipo de leche de que se trate, mediante éter etílico y éter de petróleo, evaporación de los disolventes y pesado del residuo, según el principio del método de Röse Gottlieb.

Material y aparatos utilizados.
-Balanza analítica.
-Probetas o matraces de extracción adecuados provistos de tapones de vidrio esmerilado, de tapones de corcho y otros dispositivos de cierre inatacables por los disolventes utilizados. Los tapones de corcho serán de buena calidad y se tratarán sometiéndolos sucesivamente a extracciones con éter etílico y con éter de petróleo. Después se introducirán, durante 20 minutos como mínimo, en agua a una temperatura de 60 ºC o incluso algo superior, y se dejarán enfriar también en agua con objeto de que estén saturados cuando se utilicen.
-Matraces de paredes delgadas y bases planas de una capacidad de 150 a 250 ml.
-Estufa de desecación bien ventilada y controlada termostáticamente, ajustada para que funcione a una temperatura de 102 ± 2 ºC, o bien en una estufa de desecación por vacío a temperatura entre 70-75 ºC, y presión menor de 50 mm de Hg).
-Materiales para facilitar la ebullición, exentos de materia grasa, no porosos ni deleznables al ser utilizados, como por ejemplo, perlas de vidrio o trozos de carburo de silicio, siendo su empleo de carácter facultativo.

Reactivos necesarios.
Todos los reactivos deben de ser de calidad pura para análisis (PA), y no dejar en la evaporación mayor cantidad de residuos que la autorizada para el ensayo en blanco. En caso necesario, los reactivos podrán destilarse de nuevo en presencia de 1 gramo, aproximadamente, de mantequilla deshidratada por 100 mililitros de disolvente. El agua que se utilice deberá ser destilada o por lo menos de igual pureza que el agua destilada.
Los reactivos necesarios son los siguientes:

-Agua destilada.

-Alcohol etílico del 96% (volumen/ volumen).

-Amonio hidróxido del 25% (en NH3).

-Cobre II sulfato 5-hidrato.

-Éter etílico.

-Éter de petróleo (40-60 º C).

-Potasio yoduro.

En el caso del amonio hidróxido del 25% (en NH3), puede tener una densidad aproximada a 20/4 de 0.910), o bien puede utilizarse una solución más concentrada, siempre que se conozca dicha concentración.
Se puede utilizar alcohol etílico del 96% (v/v) o, en su defecto, alcohol etílico desnaturalizado con alcohol metílico, metiletilcetona, benceno o éter de petróleo.
El éter etílico utilizado debe estar exento de peróxidos. En este sentido, para el ensayo de los peróxidos, hay que añadir a 10 ml de éter etílico mediante una pequeña probeta con tapón de vidrio, previamente enjuagada con un poco de éter, y 1 ml de solución al 10% de potasio yoduro recién preparada. A continuación, se agita y se deja reposar durante 1 minuto, no debiendo aparecer coloración amarilla en ninguna de las dos capas. Asimismo, el éter etílico puede mantenerse exento de peróxidos, añadiendo una lámina de zinc húmeda, que deberá sumergirse completamente en una solución ácida diluida de cobre II sulfato 5-hidrato durante 1 minuto, y lavarse después con agua destilada. En este caso, hay que utilizar, por litro de éter etílico, una superficie de 80 cm2 aproximadamente de lámina de zinc cortada en bandas lo suficientemente largas para que lleguen por lo menos, hasta el centro del recipiente.

El éter de petróleo debe tener su punto de ebullición entre los 30º y 60º C, o en su defecto, hay que usar éter de petróleo 40-60 ºC.

El disolvente mixto, debe prepararse poco tiempo antes de su utilización, mezclando volúmenes iguales de éter etílico y éter de petróleo. Asimismo, la mezcla de disolventes se podrá sustituir en aquellos casos en que su utilización esté prevista por éter etílico o por éter de petróleo.

Procedimiento analítico.
1.Preparación de la muestra: Se emplean dos tipos de técnicas, según la naturaleza de las muestras:
a)Leche concentrada y leche evaporada: Agitar e invertir el recipiente que contiene la muestra. Abrir y trasvasar lentamente la leche a un segundo recipiente provisto de cierre hermético. Mezclar mediante trasvases sucesivos, teniendo cuidado de incorporar a la muestra toda la materia grasa u otros constituyentes adheridos a las paredes o al fondo del primer recipiente. Finalmente, trasvasar la leche lo más completamente posible al segundo recipiente y cerrar este último. En caso necesario, templar el envase original, cerrado, en baño de María a 40-60 ºC. Sacarlo y agitar vigorosamente cada 15 minutos. Al cabo de 2 horas, retirar el envase y dejarlo enfriar hasta temperatura ambiente. Quitar totalmente la tapadera y mezclar cuidadosamente removiendo el contenido con una cuchara o espátula. Se debe tener en cuenta de que en el caso de que la materia grasa se separase del resto, no se debe efectuar el análisis de la muestra. Si se utilizan envases flexibles, es necesario abrirlos y trasvasar el contenido a un vaso. Raspar o rasgar los envases, previamente, con objeto de despegar todas la materias adheridas a las paredes e introducirlas en el vaso.
b)Leche condensada: Abrir el recipiente que contiene la muestra y mezclar cuidadosamente la leche con una cuchara o espátula. Imprimir a este instrumento un movimiento rotativo ascendente y descendente de manera que las capas superiores e inferiores se mezclen bien con el resto del contenido. Es necesario tener cuidado de reincorporar a la muestra toda la masa de leche que pudiera haberse adherido a las paredes y a los fondos del recipiente. Trasvasar la leche lo más completamente posible a un segundo recipiente provisto de cierre hermético, y cerrar este último. En caso necesario, templar el bote original, cerrado, en baño de María a 30-40 ºC. Abrir el bote, desprender toda la leche adherida a las paredes del mismo, y trasvasarla a una cápsula lo suficientemente grande para permitir un manejo cuidadoso, mezclándola hasta que toda la masa sea homogénea. Si se utilizan tubos flexibles, se abren y se trasvasa su contenido a un vaso, rasgando los tubos, con objeto de despegar todas las materias adheridas a las paredes antes de introducirlas en el vaso.
2.Ensayo en blanco: Al mismo tiempo que se determina el contenido en materia grasa de la muestra, se debe efectuar un ensayo en blanco con 10 ml de agua destilada (PA) en lugar de la muestra, empleando el mismo tipo de aparato de extracción, idénticos reactivos en iguales cantidades según el procedimiento que se describe a continuación. Si el resultado del ensayo en blanco excede 0,5 mg, habrá que comprobar los reactivos procediendo, en su caso, a su sustitución o purificación.
3.Determinación del parámetro composicional: Proceder igual que en la metodología ya descrita para el análisis de las leches natural, certificada, higienizada y esterilizada (ver entrada de este blog del día 19/02/2014, publicado hora: 04.39), excepto que en este caso hay que pesar de 4 a 5 gramos de la muestra, añadiendo a continuación 7 mililitros de agua destilada, agitando suavemente y calentando ligeramente (40-50 ºC), hasta la dispersión total del producto.

Expresión de los resultados.
Proceder igual que en la metodología ya descrita para el análisis de las leches natural, certificada, higienizada y esterilizada (ver entrada de este blog del día 19/02/2014, publicado hora: 04.39).

Referencias.

-Norma internacional FIL-IDF 13A: 1969.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO LACTOCOAGULACIÓN DE LECHE-1

Continuando con las técnicas de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la prueba de la lactocoagulación de la leche.

Principios y fundamentos metodológicos. 

Esta prueba consiste en determinar la aptitud de la leche para la coagulación durante el proceso de elaboración del queso. Se trata de una prueba visual mediante la realización de un ensayo de fermentación de la leche por adición de una cantidad conocida de cuajo, y la observación de las características del coágulo formado.

Material y aparatos utilizados.
-Baño maría con control de temperatura.
-Vasos de precipitados de 50 ml.
-Pipetas graduadas.
-Varilla de vidrio para agitación.
-Termómetro.

Reactivos necesarios.
-Agua destilada.
-Cuajo líquido o en polvo, de fuerza o poder coagulante conocidos.

Procedimiento analítico.
1.Preparación del cuajo: Según la fuerza del cuajo y su presentación (líquida o en polvo), se diluye una cierta cantidad en agua destilada.
2.Presentación de las muestras de leche: Se introducen en cada uno de los vasos de precipitados las mismas cantidades de las muestras de leche previamente numeradas, y cuya aptitud coagulante se quiere conocer.
3.Adición del cuajo: A cada una de las muestras de leche se le añade la misma cantidad de la disolución de cuajo preparada previamente, y se agita durante unos 30 segundos.
4.Tiempo de coagulación: Los vasos con las muestras de leche añadidas con la disolución del cuajo se colocan en el baño maría a una temperatura de 35-40 ºC, durante 1 hora aproximadamente.
5.Secado y escurrido de las muestras coaguladas: Una vez coaguladas las muestras de leche se sacan del baño maría y se dejan reposar durante unas 4 horas; transcurrido este tiempo, se extraen los 'quesitos' de los vasos de precipitados y se dejan escurrir para favorecer su secado y la eliminación del suero.
6.Valoración de la lactocoagulación: Una vez que los 'quesitos' se han secado, se cortan longitudinalmente y se procede a su valoración organoléptica.

Expresión de los resultados.

Los resultados del ensayo de la aptitud coagulante de las muestras de leche, se realizan mediante los sentidos de la vista y el tacto. En el caso de leches de calidad óptima, los 'quesitos' obtenidos deben presentar un aspecto normal, suave, y sin ojos; mientras, que los que tengan una textura áspera, esponjosa, 'abarquillada' o hinchada, corresponden a las muestras de leche de mala calidad y, por tanto, no aptas para su empleo en la elaboración de quesos.

Referencias.
-Curso de Tecnología de la Fabricación de Quesos. Universidad Politécnica de Madrid, 1975.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO VALOR CRIOSCÓPICO DE LECHE-1

Continuando con las técnicas oficiales de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación del valor crioscópico o 'punto' de congelación de la leche.

Principios y fundamentos metodológicos. 

El punto de congelación de la leche fresca normal es sensiblemente constante, e inferior a la temperatura de congelación del agua, oscilando alrededor de -0,55 ºC, por lo que puede utilizarse como prueba de laboratorio para determinar la posible adición de agua a la leche.

Material y aparatos utilizados.
-Crioscopio clásico, aún en funcionamiento en algunas industrias, compuesto por un tubo de vidrio vertical, de 22 x 220 mm, con un tapón al que se fija un termómetro graduado en 0,01 ºC, que se introduce hasta unos 10 mm del fondo del tubo. La longitud del termómetro y su escala vienen condicionadas por la realización de la lectura del punto de congelación fuera del tubo vertical. Asimismo, alrededor del tubo se coloca un agitador de hilo metálico terminado en espiral en su extremo inferior, que puede manipularse verticalmente sobre el vástago graduado que atraviesa el tapón. Este tubo se introduce dentro de otro tubo, de dimensiones de 28 x 200 mm, llegando a unos 10 mm del fondo; entre ambos tubos se añade alcohol etílico de 95 º. Los dos tubos se colocan en un recipiente aislado, que contiene una mezcla frigorífica a una temperatura de -4 ± 2 ºC, que se puede preparar a base de 5 partes de hielo, y 1 parte de sal.
-Crioscopios modernos. Actualmente, se utilizan equipos compactos, automatizados y adaptados para analizar un elevado número de muestras de leche por hora, y con valores de lecturas almacenadas en equipos informáticos.

Procedimiento analítico.
1.Preparación e introducción de la muestra: En el tubo central se introducen 40 ml de la muestra de leche, se coloca el tapón, y se coloca dentro del recipiente que contiene la mezcla refrigerante; seguidamente, se agita la muestra de leche mediante el uso del agitador, y se mide la temperatura con el termómetro, que en una primera etapa desciende por debajo de la temperatura de fusión del hielo, y posteriormente, comienza a subir hasta estabilizarse a la temperatura de congelación, realizándose entonces una primera lectura en el termómetro.
2.Retirar el crioscopio de la mezcla refrigerante: Se puede atemperar ligeramente la muestra de forma manual, sin interrumpir la agitación de la misma, hasta que el valor de la temperatura comience a subir.
3.Introducir nuevamente el crioscopio en la mezcla refrigerante: Se agita la muestra y se realiza una segunda lectura de la temperatura en las mismas condiciones que la primera.

Expresión de los resultados.
Los resultados obtenidos en esta técnica analítica son fiables únicamente en las muestras de leche fresca y no en las leches alteradas o que contienen conservantes químicos. En las muestras de leche acidificadas ligeramente se puede obtener un valor aproximado del punto crioscópico utilizando un factor de corrección. Antes de la medida de la temperatura de la muestra, se debe calibrar el termómetro utilizando una solución de agua destilada a 0 ºC, y una dilución de cloruro potásico en agua destilada con una concentración de 22,36 g por 1.000 ml de agua, a una temperatura de -1 ºC.

Referencias.
-Curso de Tecnología de la Fabricación de Quesos. Universidad Politécnica de Madrid, 1975.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO RESIDUO INSOLUBLE DE SANGRE EN LECHE-1

Continuando con las técnicas oficiales de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación de la presencia de residuo insoluble de sangre en la leche.

Principios y fundamentos metodológicos. 

Mediante dilución de la sangre en suero fisiológico, posterior filtración y desecación se obtiene el residuo insoluble, cuyo porcentaje se determina mediante su pesaje. Este método es aplicable a leches en polvo, que pueden contener harina de sangre de las denominadas comercialmente solubles.

Material y aparatos utilizados.
-Embudo cilíndrico esmerilado con placa filtrante, soldada al mismo, de 65 mm de diámetro y porosidad de tipo 1. Su peso debe ser inferior al límite máximo de pesada de las balanzas analíticas, lo que normalmente se consigue con una altura del cilindro igual o inferior a 4 cm.
-Agitador electromagnético.
-Estufa de desecación.

Reactivos necesarios.
-Acetona (PA).
-Ácido clorhídrico al 37,5% (PA).
-Agua desionizada (PA).
-Agua destilada (PA).
-Hidrógeno peróxido al 30% (p/v, 100 volúmenes).
-Sodio cloruro (PA).
-Suero salino fisiológico.

El suero salino fisiológico se obtiene disolviendo 9 g de sodio cloruro (PA) en 1.000 ml de agua destilada (PA).

Procedimiento analítico.
1.Pesar aproximadamente 1 g de la muestra, medida con la precisión del miligramo, y colocarla en el interior de un vaso de precipitados de 250 ml diluyendo con 50 ml de suero salino fisiológico, agitando con un agitador electromagnético durante cinco minutos. A continuación, verter y filtrar el líquido poco a poco en el embudo cilíndrico con placa filtrante, previamente desecado y pesado con la precisión del miligramo y filtrar con ayuda de vacío. Lavar el agitador y el vaso con pequeñas cantidades de suero salino fisiológico, que se vierten luego en el embudo hasta completar la filtración con una cantidad aproximada de 200 ml de líquido de lavado. Seguidamente, hay que lavar el embudo y la placa dos veces con agua destilada (PA), y añadir después 10 ml de acetona (PA), procurando empapar bien la placa. Someter a vacío durante unos minutos. Después se lleva el embudo a una estufa y se deseca a 100-105 ºC hasta peso constante (con precisión del miligramo).
2.Limpieza del embudo cilíndrico con placa filtrante. Se acopla el embudo cilíndrico en un erlenmeyer, y sobre la placa filtrante se vierten unos 50 ml de hidrógeno peróxido al 30% (p/v, 100 volúmenes), y de 1 a 5 ml de ácido clorhídrico al 37,5% (PA). Dejar reposar durante unas 24 horas y añadir, si es necesario, más cantidad de hidrógeno peróxido al 30%, y de ácido clorhídrico al 37,5% (PA), con objeto de completar la limpieza. Finalmente, se lava repetidamente el cilindro y la placa con agua desionizada.

Expresión de los resultados.

La cantidad de residuo insoluble de sangre en la leche se calcula mediante la siguiente fórmula:

Cantidad de residuo insoluble de sangre (en %) = 100 x P1/ P2
teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:

R = % residuo insoluble.
P1 = peso (en gramos) del residuo obtenido por diferencia de pesadas del embudo cilíndrico.
P2 = peso (en gramos) de la muestra.

Referencias.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: SUSTANCIAS PROTEICAS REDUCTORAS EN LECHE-1

Continuando con las técnicas oficiales de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación de la presencia sustancias proteicas reductoras en la leche.

Principios y fundamentos metodológicos. 

Determinación de las sustancias proteicas reductoras de la leche, mediante reacción con potasio ferricianuro, y posterior valoración colorimétrica. Este método es aplicable a la detección de leche en polvo reconstituida en leche cruda o pasterizada.

Material y aparatos utilizados.
-Espectrofotómetro que permite lecturas de 610 nm con cubetas de 1 cm.
-Centrífuga a 1000-1500 revoluciones por minuto (r.p.m.).
-Tubos de centrífuga graduados a 50 ml.
-Baño de agua de temperatura regulable hasta 80 ºC.

Reactivos necesarios.
-Ácido acético glacial (PA).
-Ácido tricloroacético (PA).
-Agua destilada (PA).
-Hierro III cloruro 6-hidrato.
-Potasio biftalato (PA).
-Potasio ferricianuro (PA).
-Potasio ferrocianuro 3-hidrato(PA).
-Sodio hidróxido al 97%, en lentejas (PA).
-Urea (PA).

La solución de ácido Acético al 5% se prepara diluyendo 50 ml de ácido acético glacial (PA) con agua destilada (PA) hasta alcanzar un volumen de 1 litro.
Se prepara una solución saturada de urea (PA) con agua destilada (PA).
Para preparar la solución tampón se disuelven 2 g de sodio hidróxido (PA) en agua destilada hasta un volumen de 250 ml; a continuación, hay que disolver 10,2 g de potasio biftalato (PA) en agua destilada hasta 250 ml. Seguidamente, mezclar 150 ml de la solución de sodio hidróxido (PA) con 200 ml de la solución de potasio biftalato (PA), diluyendo hasta 800 ml, y ajustar la solución final a un valor de pH de 5,6, mediante la adición de las soluciones de sodio hidróxido o potasio biftalato.
La solución de potasio ferricianuro (PA) al 1% se prepara disolviendo 10 g de potasio ferricianuro (PA) en agua destilada (PA) hasta un volumen de 1 litro. Esta solución no debe utilizarse si presenta un color verde o contiene un precipitado azul, y únicamente deberá utilizarse recién preparada.
Para la solución de ácido tricloroacético al 10% hay que disolver 100 g de ácido tricloroacético (PA) en agua destilada (PA) y alcanzar un volumen de 1 litro.
En la preparación de la solución de hierro III cloruro 6-hidrato al 0,1%, se disuelven 0,1 g de hierro III cloruro 6-hidrato (PRS) en agua destilada (PA), hasta obtener a 100 ml, debiéndose utilizarse esta solución recién preparada.
En la solución de potasio ferrocianuro de 0,05 mg/ml se pesan 0,1147 g de potasio ferrocianuro 3-hidrato (PA), y se diluye con agua destilada (PA) hasta un volumen de 1 litro. En un matraz aforado se diluyen 50 ml de esta solución hasta obtener 100 ml, de modo que cada ml contiene 0,05 mg de potasio ferrocianuro anhidro; debido a que este reactivo se oxida fácilmente con el aire se debe utilizar inmediatamente después de su preparación.

Procedimiento analítico.
1.Preparación de la curva de referencia: Se colocan en los tubos de ensayo, los siguientes volúmenes de la solución de potasio ferrocianuro (0.05 mg/ml), medidos con pipeta: 0.5; 1.0; 1.5; 2.0; 2.5; 3.0; 3.5; 4.0 ml, dejando un tubo sin solución (0.0); a continuación, se añade agua destilada (PA) hasta alcanzar un volumen total de 5 ml. 
Asimismo, a todos los tubos de ensayo se les añade 5 ml de la “solución blanco” preparada como se describe a continuación: Diluir 3 ml de la solución de urea (PA) en 15 ml con agua destilada (PA), en un tubo de centrífuga, añadir 5 ml de la solución tampón, 5 ml de la solución de potasio ferricianuro y 5 ml de la solución de ácido tricloroacético. Mezclar bien con una varilla de vidrio. Para hacer la curva de referencia, no hay que calentar ni filtrar la “solución blanco”; sin embargo, a la hora de analizar las muestras, la "solución blanco" se calienta y se filtra igual que en las condiciones del ensayo. A intervalos convenientes, añadir 1 ml de la solución de hierro III cloruro al 0,1%, para desarrollar el color, después hay que agitar y dejar en reposo exactamente durante 10 minutos. Ajustar el 100% de transmitancia con la solución control (tubo de 0,0 ml) de disolución de potasio ferrocianuro a 610 nm. Leer, a continuación, en transmitancia las distintas preparaciones de las soluciones patrones y representar los valores obtenidos frente a concentraciones en mg de potasio ferrocianuro en papel de escala semilogarítmica. Finalmente, preparar la curva de referencia con cada serie de análisis.
2.Determinación del parámetro composicional: Mantener las muestras aproximadamente a 3 ºC; las muestras congeladas o conservadas son inadecuadas para la determinación. Pipetar 15 ml de la muestra previamente homogeneizada en un tubo de centrífuga graduado de 50 ml, que contenga 15 ml de agua destilada (PA). Añadir 3 ml de la solución de ácido acético al 5%, agitar bien con una varilla de vidrio, y centrifugar durante 5 minutos. Decantar el líquido sobrenadante. Puede suceder que una pequeña proporción del precipitado quede flotando en la parte superior del tubo después de centrifugar; en el caso de que la mayor parte del precipitado permanezca en el fondo del tubo, entonces no se tendrá en cuenta en el procedimiento. Sin embargo, si la muestra contiene una cantidad excesiva de nata, el precipitado flotará y no podrá separarse el sobrenadante, por lo que hay que anular esta determinación y volver a mezclar la muestra completamente. Seguidamente, se lava el precipitado dos veces con volúmenes de 15 ml de agua destilada (PA), mezclando cada vez el precipitado con una varilla de vidrio, centrifugar 15 minutos y decantar. Tanto al precipitado como a un tubo de centrífuga limpio que se llevará paralelamente como "blanco", se añaden 3 ml de solución de urea y se diluyen hasta 15 ml con agua destilada (PA). A continuación, hay que agitar, añadir 5 ml de solución tampón y 5 ml de la solución de potasio ferrocianuro al 1%, agitando nuevamente, y colocar en un baño de agua a 70 ºC, exactamente 20 minutos y enfriar en hielo. Una vez enfriada, añadir 5 ml de la solución de ácido tricloroacético al 10%, agitar, y filtrar a través de un papel Whatman nº 40 de 11 cm o similar. Usar los primeros 5 ml del filtrado para lavar las paredes y el fondo del recipiente, eliminándolos. Verter el resto de la solución sobre el filtro y dejar que se filtre completamente; en el caso de que el filtrado sea turbio, hay que filtrarlo nuevamente. Introducir 5 ml de agua destilada (PA) en un tubo de ensayo, y añadir 5 ml del filtrado claro; posteriormente, se añade 1 ml de la solución de hierro III cloruro al 0,1% para que se desarrolle el color, se agita y se deja en reposo exactamente 10 minutos. Ajustar el 100% de transmitancia a 610 nm con el "blanco" y efectuar la lectura. Con las series de muestras, añadir la solución de hierro III cloruro a intervalos adecuados para permitir las lecturas después del período de 10 minutos.

Expresión de los resultados.

A partir de la curva de referencia, determinar la cantidad de sustancias reductoras, expresada como miligramos de potasio ferrocianuro por 100 mililitros de leche, multiplicando el valor obtenido de la curva por 40.

Observaciones.

Los análisis deben terminarse el mismo día que se comiencen; es muy importante que las muestras no permanezcan almacenadas demasiado tiempo después de su enfriamiento o después de la filtración. Asimismo, durante la determinación el laboratorio debe estar libre de vapores oxidantes o reductores (H₂S, CL₂, NH₃, etc.).

Referencias.
-Official Methods of Analysis of the AOAC. Ed. 1975, Nº 16.047-16.050.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO FÉCULA Y SALVADO EN LECHE-1

Continuando con las técnicas oficiales de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación de la presencia de fécula-salvado en la leche por el método gravimétrico.

Principios y fundamentos metodológicos. 

Separación por centrifugación de la fécula y del salvado, y determinación gravimétrica. Se denomina "fécula" a la sustancia pulverulenta de los granos de almidón presentes en ciertos vegetales.

Material y aparatos utilizados.
-Centrífuga de 3.000 revoluciones por minuto (r.p.m.).
-Estufa de desecación al vacío. 

Reactivos necesarios.
-Agua destilada (PA).
-Lugol en solución (yodo-yodurada), o bien prepararla mezclando 1 g de yodo resublimado (PRS), y 1 g de potasio yoduro (PA) en agua destilada (PA) hasta 200 ml; la solución se coloca en el interior de un frasco cuentagotas.

Procedimiento analítico.

Pesar 0,5 g de la muestra de leche a analizar, con una aproximación de 0,001 g, y colocarla en un tubo de centrífuga previamente pesado con igual exactitud. Añadir 10 ml de agua destilada (PA) fría, y agitar con una varilla de vidrio hasta la disolución de la leche. A continuación, centrifugar la disolución a 3.000 r.p.m. Seguidamente, hay que decantar la emulsión sobrenadante, y añadir 10 ml de agua destilada fría al residuo insoluble; agitar de nuevo con una varilla, centrifugar otros 15 minutos a idénticas revoluciones y luego, decantar. Repetir estas operaciones al menos cuatro veces. Los líquidos obtenidos por decantación tras la centrifugación no deben dar coloración azul con el lugol en solución yodo-yodurada. Desecar a 80 ºC en estufa de vacío el residuo final contenido en el tubo de centrífuga, hasta peso constante. El peso del residuo representará el peso total del desnaturalizante contenido en 0,5 g de la leche desnaturalizada.

Expresión de los resultados.

El salvado contiene una humedad media que puede cifrarse en un 10%; por ello, el peso del residuo centrifugado debe incrementarse en la humedad correspondiente al salvado contenido en la muestra de 0,5 g de leche, que en el caso de que sea un producto correctamente desnaturalizado (al 20%), este incremento de peso será de 0,008 g.

El peso de la cantidad desnaturalizada total se calcula mediante la siguiente fórmula:

Cantidad desnaturalizada (en %) = 100 x (Rs + h)/ P
teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:

Rs = peso (en gramos) del residuo final.
h = factor de corrección de humedad del salvado = 0,008 g.
P = peso (en gramos) de la leche desnaturalizada.

Referencias.

-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO PRESENCIA DE SALVADO EN LECHE-1

Continuando con las técnicas oficiales de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación de la presencia de salvado en la leche por el método gravimétrico.

Principios y fundamentos metodológicos. 

Separación por tamizado del salvado y determinación gravimétrica. Se denomina "salvado" a la cáscara o parte exterior de los granos de cereales, desmenuzada por la molienda.

Material y aparatos utilizados.
-Tamiz de 0,210 mm de luz de malla.
-Tamiz de 0,074 mm de luz de malla.
-Estufa de desecación.

Procedimiento analítico.
Pesar 20 g de la muestra de leche, con una precisión de 0,01 g, y tamizarla mediante el uso del tamiz estándar de 0,210 mm de malla, recogiendo cuidadosamente la fracción de salvado retenida por el tamiz y se procede a pesarla. A continuación, se añade agua destilada (PA) a la parte tamizada, formando una pasta, deshaciendo todos los grumos que puedan formarse con ayuda de una varilla de vidrio con el extremo curvado en forma de U, y luego diluir con agua destilada hasta completar unos 300 ml de volumen total. Verter la emulsión obtenida sobre el tamiz de 0,074 mm de luz de malla, previamente desecado a 100 ºC hasta peso constante; lavar repetidamente el residuo que permanece en el tamiz hasta conseguir que las aguas de lavado sean transparentes e incoloras. Finalmente, hay que desecar el tamiz en una estufa a 100 ºC hasta peso constante.

Expresión de los resultados.

El contenido en salvado en 100 g de la muestra (Ps) viene dado por la siguiente fórmula:

Ps = 5 x (a + 1,3 x b)

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:

b = peso (en gramos) de la fracción de salvado retenida por el tamiz de 0,074 mm de luz de malla.
a = peso (en gramos) de la fracción de salvado retenida por el tamiz de 0,210 mm de luz de malla.

Se estima que la pérdidas del salvado debidas a los procesos de lavado y desecación son de aproximadamente del 30%.

Referencias.

-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: FÉCULA EN LECHE DESNATURALIZADA-1

Continuando con las técnicas oficiales de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación de la presencia de fécula en la leche por el método comparativo.

Principios y fundamentos metodológicos. 

Determinación de fécula en leche desnaturalizada por comparación con muestras patrón.

Material y aparatos utilizados.
-Matraz aforado de 100 ml.
-Probeta de 100 ml.
-Pipeta de 10 ml.

Reactivos necesarios.
-Agua destilada (PA).
-Yodo 0,1 N.

Procedimiento analítico.
1.Preparación del desnaturalizante patrón: Mezclar bien 80 g de salvado y 20 g de fécula de la misma naturaleza que la que se pretende identificar.
2.Preparación de patrones de leche descremada en polvo desnaturalizante patrón: Mezclar usando el mortero, según las siguientes proporciones:

Patrón nº	Leche descremada en polvo (g)	Desnaturalizante patrón (g)
1	85	15
2	80	20
3	75	25

3.Determinación del parámetro composicional: Hay que pesar exactamente 1 g de la muestra con precisión de 0,01 g, se trasvasa a un mortero y se prepara una papilla añadiendo 25 ml de agua destilada (PA) hirviendo, vertiéndose seguidamente en un matraz aforado de 100 ml. Lavar el mortero con agua destilada caliente repetidas veces, vertiendo los líquidos de lavado en el matraz hasta obtener unos 75 ml. A continuación, se agita enérgicamente y se lleva a un baño de María durante diez minutos, agitando cada cierto tiempo; enfriar el matraz al 'chorro de agua' fría y obtener un contenido exactamente de 100 ml. Se extraen 10 ml exactamente medidos y se introducen en una probeta de 100 ml. Añadir 80 ml de agua destilada (PA), 1 ml de solución de yodo 0,1 N, completar hasta el enrase con agua destilada (PA), y agitar enérgicamente. Se debe verificar el mismo método con los tres patrones preparados, comparando el color de la muestra, a los cinco minutos, con el de los tres patrones.

Referencias.

-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: FENOLFTALEÍNA EN LECHE DESNATURALIZADA-1

Continuando con las técnicas oficiales de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la detección de fenolftaleína en leche desnaturalizada mediante el método cualitativo.

Principios y fundamentos metodológicos. 

Detección de la existencia de fenolftaleína en leche desnaturalizada en presencia de una solución alcalina.

Material y aparatos utilizados.
-Tubos de ensayo 160/60.

Reactivos necesarios.
-Agua destilada (PA).
-Sodio hidróxido 2 N.

Procedimiento analítico.
En un tubo de ensayo de 160/60, se añaden aproximadamente 0,5 g de leche en polvo, y 10 ml de agua destilada (PA), agitando hasta lograr una emulsión uniforme. Seguidamente, se añaden 2 ml de solución de sodio hidróxido 2 N. La presencia de fenolftaleína en la muestra se manifiesta por la aparición de una serie de puntos de color rojo-rosado que se ensanchan, intensificando su coloración hasta alcanzar su máxima intensidad, que se va perdiendo progresivamente hasta llegar a desaparecer transcurrido un cierto tiempo. Se procede comparando con un patrón de leche en polvo conteniendo fenolftaleína al 1/20.000.

Referencias.

-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: HARINA DE ALFALFA EN LECHE-2

Continuando con las técnicas oficiales de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación de la presencia de harina de alfalfa en la leche por el método gravimétrico.

Principios y fundamentos metodológicos. 

Separación de las partículas de alfalfa, por lavado con agua y posterior determinación gravimétrica.

Material y aparatos utilizados.
-Vaso de precipitados de 250 ml.
-Tamiz de 0,25 mm de luz de malla.
-Embudo.
-Matraz Erlenmeyer de 2.000 ml.
-Trompa de vacío.
-Placa filtrante de vidrio número 1.
-Estufa de desecación.

Procedimiento analítico.
Esta técnica consiste en pesar 50 g de leche desnaturalizada, utilizando un vaso de precipitados de 250 ml, y añadir 150 ml de agua destilada (PA), procurando que se vaya impregnando la leche de la muestra y se va agitando mediante una varilla con el extremo curvado en forma de U, hasta formar una especie de papilla de grano muy fino. A continuación, se añaden otros 100 ml de agua destilada, se agita y se pasa la papilla a través del tamiz de 0,25 mm de luz de malla, previamente desecado a 100 ºC hasta peso constante, con  una precisión de 0,01 g. Este tamiz se coloca sobre un embudo y éste a su vez sobre un matraz erlenmeyer de 2.000 ml. Seguidamente, se lavan el vaso y el tamiz añadiendo poco a poco agua destilada a 40 ºC en 'chorro fino', removiendo los pequeños grumos con ayuda de la varilla de vidrio hasta que toda la leche haya sido arrastrada por el agua. Se precisan aproximadamente 1,5 litros. Luego, se deja escurrir el tamiz y se deseca en la estufa a 100 ºC, colocado sobre un papel de filtro. Una vez desecado el tamiz hasta peso constante, se pesa con una aproximación de 0,01 g, recogiéndose en él previamente las partículas que pudieran haber caído en el papel de filtro a medida que se producía la desecación de la alfalfa, y se anota el peso obtenido (p1). Por otra parte, hay que tener en cuenta que las partículas de alfalfa, a causa de la humedad, sufren un hinchamiento, por lo que es necesario tamizar de nuevo después de la desecación y de exponer el tamiz a humedad ambiente durante dos horas, obteniéndose así el peso de la cantidad retenida por el mismo (p2). Filtrar a vacío la leche recogida en el erlenmeyer a través de la placa filtrante número 1, cuyo fondo y paredes se han recubierto de algodón; antes de iniciarse la filtración, pesar con aproximación de 0,01 g, la placa y el algodón previamente desecados a 100 ºC. La filtración se realiza añadiendo la leche poco a poco sobre el centro de la placa, cuidando de que el vacío no sea demasiado intenso para evitar la formación de espuma, y lavar con abundante agua destilada a 40 ºC hasta que ésta pase completamente transparente. Desecar la placa a 100 ºC hasta peso constante, y pesar con aproximación de 0,01 g, obteniéndose así el peso de las partículas de alfalfa (p3).

Expresión de los resultados.

La humedad propia de la harina de alfalfa se estima en un 8%; los valores reales de la harina de alfalfa total contenida en 50 g de muestra (P) y de la retenida por el tamiz (p), se calculan de la siguiente manera:

Contenido de harina de alfalfa (en %) P = p2  x (p1 + p3 + 8/100 x (p1 + p2))

siendo: P = p2

Referencias.

-A. López, M. del C. Díaz Peñalver, y J Gutiérrez: “Leches desnaturalizadas. Comprobación de la desnaturalización de las mismas”.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: HARINA DE ALFALFA EN LECHE-1

Continuando con las técnicas oficiales de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación de la presencia de harina de alfalfa en la leche por el método comparativo.

Principios y fundamentos metodológicos. 

Esta técnica analítica se fundamenta en la determinación de la posible presencia de harina de alfalfa en leche desnaturalizada, por comparación visual y microscópica, frente a las muestras patrón de referencia.

Material y aparatos utilizados.
-Tamiz de 0,25 mm de luz de malla.
-Lupa para 10 a 20 aumentos.
-Material necesario para la observación microscópica.

Procedimiento analítico.
1.Preparación de la muestra patrón de harina de alfalfa: Mezclar íntimamente muestras de harina de alfalfa adquiridas en el mercado (molidas en grano fino). Seguidamente, se procede al tamizado de la harina obtenida empleando el tamiz de 0,25 mm de luz de malla, separando las dos fracciones, que se mezclan en la siguiente proporción: 98 partes de la fracción más fina y 2 de la más gruesa. Dicha mezcla se considera como la muestra patrón de harina de alfalfa.
2.Preparación de las muestras patrón de leche en polvo-harina de alfalfa: Mezclar y homogeneizar la leche en polvo sin desnaturalizar, y la muestra patrón de harina de alfalfa obtenida, según las siguientes proporciones:

Leche en polvo (g)	Harina de alfalfa (g)	Harina de alfalfa (%)
99,0	1,0	1,0
98,5	1,5	1,5
98,0	2,0	2,0
97,5	2,5	2,5
97,0	3,0	3,0
96,5	3,5	3,5
96,0	4,0	4,0

Con estas muestras patrón hay que realizar una serie de preparaciones colocando en el centro de un portaobjetos, 0,6 g aproximadamente de cada una de las muestras, cubriéndose las mismas con otro portaobjetos, extendiendo el polvo mediante compresión y giro de los dos vidrios, hasta lograr una lámina circular de unos 2 cm de diámetro. Sujetar los dos portaobjetos fijando los extremos con papel adhesivo transparente. La colección de patrones así obtenida se conserva para ulteriores determinaciones.

3.3.Determinación de la harina de alfalfa contenida en la muestra de leche en polvo a analizar: Obtener una preparación en forma análoga a la anteriormente descrita y comparar con las muestras patrón de leche en polvo-harina de alfalfa, separando aquéllas que, a simple vista, sean análogas o muy próximas a la muestra problema. Proceder seguidamente a una comparación microscópica entre la muestra a analizar y cada una de las muestras separadas, empleando lupa de 10 a 20 aumentos, considerando tanto el tamaño como la densidad de las partículas que aparecen en una serie de campos, obteniendo valores medios y expresando los resultados en porcentaje de harina de alfalfa contenida en le leche en polvo analizada.

Referencias.

-A. López, M. del C. Díaz Peñalver, y J Gutiérrez: “Leches desnaturalizadas. Comprobación de la desnaturalización de las mismas”.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: FÓSFORO EN LECHE-1

Continuando con los métodos oficiales de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación del contenido de fósforo en la leche.

Principios y fundamentos metodológicos. 

Se entiende por contenido en fósforo en leche la cantidad total de fósforo, expresada en porcentaje en peso, determinada por el procedimiento expuesto a continuación, y que corresponde a la norma FIL-42: 1967, de la Federación Internacional de Lechería (FIL). Este método se aplica a todas las leches líquidas normales, así como a las leches reconstituidas por dilución o disolución de las leches concentradas o de las leches desecadas.
Las materias orgánicas de la leche se destruyen por un proceso de mineralización en seco (incineración), y el fósforo se determina colorimétricamente, reduciendo el amonio fosfomolibdato con diaminofenol (amidol), y midiendo la densidad óptica de la solución obtenida.

Material y aparatos utilizados.
-Balanza analítica.
-Cápsulas de platino o de cuarzo, de 55 mm de diámetro aproximadamente, y provistas de vidrio de reloj.
-Baño de agua.
-Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml.
-Matraces aforados, de 25 ml con tapones esmerilados, de 100 y de 1.000 ml.
-Horno mufla.
-Estufa a 105 ± 2 ºC.
-Espectrofotocolorímetro.

Reactivos necesarios.
-Ácido clorhídrico 1 N.
-Ácido perclórico al 70% (PA).
-Agua destilada (PA).
-Amonio molibdato 4-hidrato (PA).
-2,4-diaminofenol diclorohidrato (amidol).
-Potasio fosfato mono-básico (PA).
-Sodio meta-bisulfito (PA).

El ácido perclórico se prepara partiendo de este reactivo al 65% (d = 1,61), o usando el ácido perclórico al 70%, y diluyendo convenientemente.
La solución de amidol se hace disolviendo, en agua destilada (PA), 1 g de 2,4-diaminofenol diclorohidrato ((NH2)2C6H3OH.2HCl), y 20 g de sodio meta-bisulfito (PA), o de sodio pirosulfito (Na2S2O5), y completar hasta 100 ml en un matraz aforado con tapón esmerilado. Se recomienda preparar una solución nueva cada día.
Para la solución de molibdato se disuelven en agua destilada (PA), 8,3 g de amonio molibdato 4-hidrato ((NH4)6Mo7O24.4H2O, completando hasta un volumen de 100 ml.
En el caso de la solución acuosa de potasio fosfato mono-básico (PA), se prepara a partir de este reactivo (KH2PO4), desecado durante 2 horas a 105 ºC, lo cual permite trazar una curva de referencia para la determinación del fósforo. Para ello, hay que pesar 4,393 g de potasio fosfato mono-básico (PA), después se disuelve en agua destilada (PA), completando hasta 1.000 ml (solución A). Seguidamente se diluyen 10 ml de solución A hasta completar 1.000 ml (solución B)., teniendo en cuenta que: 1 mililitro de solución B = 10 microgramos de fósforo (P).
Todos los reactivos utilizados en esta técnica analítica deben ser puros para el análisis (PA).

Procedimiento analítico.
1.Preparación de la muestra: Antes del análisis hay que atemperar la muestra a 20 ± 2 ºC y mezclar cuidadosamente; en el caso de no obtener una dispersión homogénea de la materia grasa, hay que calentar lentamente la muestra a 40 ºC, agitando suavemente y luego, enfriar a 20 ± 2 ºC.
2.Ensayo en blanco: Efectuar un ensayo en blanco usando todos los reactivos, del mismo modo que se procede en la técnica detallada en el siguiente apartado 3.3 (determinación colorimétrica del fósforo), con la excepción de que se reemplazan los 5 ml de la dilución por 5 ml de agua destilada (PA).
3.Determinación del parámetro composicional: Hay que realizar las cuatro operaciones siguientes:
3.1.Mineralización por vía seca: En una cápsula de platino o de cuarzo pesar exactamente alrededor de 10 g de leche con una aproximación de 10 mg. Evaporar, hasta sequedad, en el baño de agua hirviendo; después de conseguir la desecación completa, hay que calcinar la muestra en la mufla a una temperatura comprendida entre 500 ºC y 550 ºC hasta la obtención de cenizas blancas.
3.2.Preparación de la solución de cenizas: Después de enfriar la cápsula, cubrirla con un vidrio de reloj, disolver las cenizas en 2 o 3 ml de ácido clorhídrico 1 N, y diluir con agua destilada (PA). Trasvasar la solución de las cenizas a un matraz aforado de 100 ml, lavar el vidrio de reloj y la cápsula, recogiendo las aguas de lavado en el matraz. Completar hasta 100 ml con agua destilada (PA), agitar y filtrar. A continuación, se extraen 10 ml del filtrado, y se introducen en un matraz de 100 ml, completándose con agua destilada y agitar.
3.3.Determinación colorimétrica del fósforo: Se miden 5 ml de de la dilución preparada en el apartado 3.2. (preparación de la solución de cenizas), y se introducen en un matraz aforado de 25 ml. Seguidamente, añadir sucesivamente 2 ml de ácido perclórico, 2 ml de la solución de amidol, y 1 ml de la solución de amonio molibdato. Completar hasta 25 ml con agua destilada (PA) y mezclar. Esperar 5 minutos y medir la densidad óptica utilizando una cubeta de 1 cm en un espectrofotocolorímetro a 750 nanómetros. Buscar en la curva patrón la cantidad de fósforo contenida en el matraz de 25 ml, expresada en microgramos, correspondiente a la densidad óptica leída.
3.4.Determinación de la curva patrón: En cuatro matraces aforados de 25 ml hay que introducir 3, 5, 7 y 10 ml de la solución B, de modo que estas cantidades así introducidas son iguales a 30, 50, 70 y 100 microgramos de fósforo. Y a continuación, se procede igual que en el apartado 3.3. Seguidamente, se trasladan a una gráfica las diversas densidades ópticas obtenidas en función de las cantidades de fósforo presentes en los matraces, y finalmente, se procede a trazar la curva patrón (que es una recta).

Expresión de los resultados.

El contenido en fósforo de la leche, expresada en g de fósforo por 100 g de leche, viene dado por la fórmula siguiente:

Contenido en fósforo (en %) = (m - m')/ 50 x M
teniendo en cuenta la siguiente nomenclatura:

m = masa de fósforo, expresada en microgramos, obtenida según el apartado 3.4., y contenida en el matraz de 25 ml con la muestra de 50 mg de leche (aproximadamente).
m' = masa de fósforo, expresada en microgramos, obtenida según el apartado 3.4., y contenida en el ensayo en blanco.
M = masa de leche, expresada en gramos, empleada para la mineralización.

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente, o una inmediatamente después de otra, por el mismo analista, no debe ser mayor de 0.008 g de fósforo por 100 g de leche.

Referencias.

-Norma Internacional FIL-IDF 42: 1967.

-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: CALCIO EN LECHE-1

Continuando con los métodos oficiales de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación del contenido de calcio en la leche.

Principios y fundamentos metodológicos.

Se entiende por contenido en calcio de la leche la cantidad total de calcio, expresada en porcentaje en peso, y determinada por el procedimiento expuesto a continuación, que corresponde a la norma FIL-36: 1966 de la Federación Internacional de Lechería (FIL). Este método se aplica a todas las leches líquidas normales, así como a las leches reconstituidas por dilución o disolución de leches concentradas o de leches desecadas.
El calcio total presente en la muestra se lleva a disolución por precipitación de las materias proteicas de la leche mediante el ácido tricloroacéico, el calcio contenido en el filtrado es precipitado bajo forma de calcio oxalato, que se separa por centrifugación y se valora con potasio permanganato.

Material y aparatos utilizados.
-Balanza analítica.
-Matraz aforado de 50 ml.
-Pipeta para leche de 20 ml.
-Papell de filtro sin cenizas para filtración lenta.
-Centrífuga que pueda desarrollar una aceleración de 1.400 g (aceleración de la gravedad).
-Tubos de centrífuga, cilíndricos, con fondo redondo de 30 ml, aproximadamente, y marcados a 20 ml.
-Pipetas de 2 y 5 ml.
-Dispositivo de sifón por succión, provisto de un tubo capilar.
-Baño de agua, a temperatura de ebullición.
-Bureta graduada.

Reactivos necesarios.
-Ácido acético glacial (PA).
Ácido sulfúrico al 96% (PA).
-Ácido tricloroacético solución al 20% (p/v).
-Agua destilada (PA).
-Alcohol etílico del 96% (v/v).
-Amonio hidróxido al 25% (en NH3).
-Amonio oxalato 1-hidrato (PA).
-Potasio permanganato 0,05 N.
-Rojo de metilo, indicador de pH.

Todos los reactivos deben de ser puros para el análisis (PA).
Se utiliza el ácido tricloroacético en solución al 20% (p/v), o bien se prepara a partir del ácido tricloroacético en solución acuosa al 12% (p/v), usando el ácido tricloroacético en solución al 20% (p/v), y se diluye convenientemente.
El amonio oxalato 1-hidrato (PA) se prepara en solución acuosa saturada en frío.
El rojo de metilo se prepara en una solución al 0,05% (p/v) en alcohol etílico al 96% (v/v).
El ácido acético se usa en una solución acuosa al 20% (v/v), a partir de ácido acético glacial (PA), y diluyendo convenientemente.
En cuanto al empleo del amonio hidróxido, en primer lugar, se prepara en una solución acuosa obtenida mezclando volúmenes iguales de amonio hidróxido al 25% (en NH3) y de agua destilada (PA). Y posteriormente, se diluye esta solución acuosa a partir de 2 ml de amonio hidróxido al 25% con agua destilada hasta alcanzar un volumen de 100 ml.
El ácido sulfúrico al 96% se prepara en una solución acuosa añadiendo 20 ml de ácido sulfúrico del 96% (PA) a 80 ml de agua destilada (PA).
Para preparar el potasio permanganato 0,02 N se introducen, en un matraz aforado de 250 ml, un volumen de 100 ml de potasio permanganato 0,05 N; a continuación, se diluye y se enrasa con agua destilada (PA), determinándose finalmente el factor de la solución 0,02 N resultante.

Procedimiento analítico.
1.Preparación de la muestra: Antes del análisis, atemperar la muestra a 20 ± 2 ºC, y mezclar con cuidado; en el caso de no obtenerse una dispersión homogénea de la materia grasa, se recomienda calentar lentamente la muestra a 40 ºC, mezclar suavemente y dejar enfriar a 20 ± 2 ºC.
2.Defecación de la muestra: En un matraz aforado de 50 ml pesar exactamente alrededor de 20 g de leche, con una aproximación de 10 mg. Añadir poco a poco mientras se agita una solución acuosa de ácido tricloroacético al 20% (p/v), completando con este reactivo hasta los 50 ml. Agitar fuertemente durante algunos segundos, y dejar reposar 30 minutos. Filtrar sobre papel de filtro sin cenizas. El filtrado obtenido debe ser límpido.
3.Precipitación del calcio en forma de oxalato y separación del oxalato: En un tubo de centrífuga cilíndrica, de fondo redondo, se introducen 5 ml del filtrado límpido, y seguidamente 5 ml de ácido tricloroacético al 12%, 2 ml de una solución acuosa saturada de amonio oxalato 1-hidrato (PA), 2 gotas de solución alcohólica de rojo de metilo, y 2 ml de ácido acético al 20%. Mezclar mediante agitación circular y añadir poco a poco solución de amonio hidróxido al 25% (en NH3) hasta conseguir una coloración amarillo pálido; después, se añaden algunas gotas de ácido acético al 20% hasta coloración rosa. Dejar reposar durante 4 horas a la temperatura ambiente. Diluir hasta 20 ml con agua destilada (PA), y centrifugar 10 minutos a 1.400 g. Mediante un dispositivo de succión, decantar el líquido límpido sobrenadante. Lavar las paredes del tubo de centrifugación (sin remover el depósito de calcio oxalato) utilizando 5 ml de solución de amonio hidróxido diluido siguiendo el segundo paso expuesto en el apartado correspondiente (reactivos necesarios). Centrifugar 5 minutos a 1.400 g, decantar el líquido sobrenadante mediante el dispositivo de succión, y realizar tres lavados sucesivos.
4.Valoración del oxalato: Después de haber extraído el agua del último lavado mediante el uso del sifón, se añaden 2 ml de solución acuosa de ácido sulfúrico, y 5 ml de agua destilada sobre el precipitado de calcio oxalato. Poner el tubo en baño de agua hirviendo y, una vez que el oxalato esté completamente disuelto, se procede a valorar con solución de potasio permanganato 0,02 N, hasta conseguir una coloración rosa persistente, manteniendo la temperatura durante la valoración por encima de los 60 ºC.
5.Ensayo en blanco: Efectuar un ensayo en blanco con todos los reactivos descritos, excepto que se sustituye la muestra de leche por 20 ml de agua destilada (PA).

Expresión de los resultados.

El contenido de calcio en la leche se calcula mediante las fórmulas siguientes:

Contenido en calcio (en %) = 0,0004 x (V - v) x K x 1.000/ P = 0,4 x (V - v) x K/ P
teniendo en cuenta la siguiente nomenclatura:

V = volumen en ml de MnO4K (0,02 N) gastados en la valoración de la muestra.
v = volumen en ml de MnO4K (0,02 N) gastados en el ensayo en blanco.
P = peso en gramos de la muestra inicial (alrededor de 20 g).
K = coeficiente de corrección del volumen del precipitado resultante de la precipitación tricoloroacética. Según el tipo de leche analizada este coeficiente tiene distintos valores numéricos:

K = 0,972, para muestras de leche entera (de 3,5 a 4,5% de materia grasa).
K = 0,976, para leche con 3% de grasa.
K = 0,980, para leche con 2% de grasa.
K = 0,985, para leche con 1% de grasa.
K = 0,989, para leche desnatada.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente o una inmediatamente después de otra por el mismo analista, no debe ser mayor de 0,002 g de calcio por 100 g de leche.

Referencias.

-Norma Internacional FIL-IDF 36: 1966.

-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)