Continuando con los métodos oficiales de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación del contenido de calcio en la leche.
Principios y fundamentos metodológicos.
Se entiende por contenido en calcio de la leche la cantidad total de calcio, expresada en porcentaje en peso, y determinada por el procedimiento expuesto a continuación, que corresponde a la norma FIL-36: 1966 de la Federación Internacional de Lechería (FIL). Este método se aplica a todas las leches líquidas normales, así como a las leches reconstituidas por dilución o disolución de leches concentradas o de leches desecadas.
El calcio total presente en la muestra se lleva a disolución por precipitación de las materias proteicas de la leche mediante el ácido tricloroacéico, el calcio contenido en el filtrado es precipitado bajo forma de calcio oxalato, que se separa por centrifugación y se valora con potasio permanganato.
Material y aparatos utilizados.
-Balanza analítica.
-Matraz aforado de 50 ml.
-Pipeta para leche de 20 ml.
-Papell de filtro sin cenizas para filtración lenta.
-Centrífuga que pueda desarrollar una aceleración de 1.400 g (aceleración de la gravedad).
-Tubos de centrífuga, cilíndricos, con fondo redondo de 30 ml, aproximadamente, y marcados a 20 ml.
-Pipetas de 2 y 5 ml.
-Dispositivo de sifón por succión, provisto de un tubo capilar.
-Baño de agua, a temperatura de ebullición.
-Bureta graduada.
Reactivos necesarios.
-Ácido acético glacial (PA).
Ácido sulfúrico al 96% (PA).
-Ácido tricloroacético solución al 20% (p/v).
-Agua destilada (PA).
-Alcohol etílico del 96% (v/v).
-Amonio hidróxido al 25% (en NH3).
-Amonio oxalato 1-hidrato (PA).
-Potasio permanganato 0,05 N.
-Rojo de metilo, indicador de pH.
Todos los reactivos deben de ser puros para el análisis (PA).
Se utiliza el ácido tricloroacético en solución al 20% (p/v), o bien se prepara a partir del ácido tricloroacético en solución acuosa al 12% (p/v), usando el ácido tricloroacético en solución al 20% (p/v), y se diluye convenientemente.
El amonio oxalato 1-hidrato (PA) se prepara en solución acuosa saturada en frío.
El rojo de metilo se prepara en una solución al 0,05% (p/v) en alcohol etílico al 96% (v/v).
El ácido acético se usa en una solución acuosa al 20% (v/v), a partir de ácido acético glacial (PA), y diluyendo convenientemente.
En cuanto al empleo del amonio hidróxido, en primer lugar, se prepara en una solución acuosa obtenida mezclando volúmenes iguales de amonio hidróxido al 25% (en NH3) y de agua destilada (PA). Y posteriormente, se diluye esta solución acuosa a partir de 2 ml de amonio hidróxido al 25% con agua destilada hasta alcanzar un volumen de 100 ml.
El ácido sulfúrico al 96% se prepara en una solución acuosa añadiendo 20 ml de ácido sulfúrico del 96% (PA) a 80 ml de agua destilada (PA).
Para preparar el potasio permanganato 0,02 N se introducen, en un matraz aforado de 250 ml, un volumen de 100 ml de potasio permanganato 0,05 N; a continuación, se diluye y se enrasa con agua destilada (PA), determinándose finalmente el factor de la solución 0,02 N resultante.
Procedimiento analítico.
1.Preparación de la muestra: Antes del análisis, atemperar la muestra a 20 ± 2 ºC, y mezclar con cuidado; en el caso de no obtenerse una dispersión homogénea de la materia grasa, se recomienda calentar lentamente la muestra a 40 ºC, mezclar suavemente y dejar enfriar a 20 ± 2 ºC.
2.Defecación de la muestra: En un matraz aforado de 50 ml pesar exactamente alrededor de 20 g de leche, con una aproximación de 10 mg. Añadir poco a poco mientras se agita una solución acuosa de ácido tricloroacético al 20% (p/v), completando con este reactivo hasta los 50 ml. Agitar fuertemente durante algunos segundos, y dejar reposar 30 minutos. Filtrar sobre papel de filtro sin cenizas. El filtrado obtenido debe ser límpido.
3.Precipitación del calcio en forma de oxalato y separación del oxalato: En un tubo de centrífuga cilíndrica, de fondo redondo, se introducen 5 ml del filtrado límpido, y seguidamente 5 ml de ácido tricloroacético al 12%, 2 ml de una solución acuosa saturada de amonio oxalato 1-hidrato (PA), 2 gotas de solución alcohólica de rojo de metilo, y 2 ml de ácido acético al 20%. Mezclar mediante agitación circular y añadir poco a poco solución de amonio hidróxido al 25% (en NH3) hasta conseguir una coloración amarillo pálido; después, se añaden algunas gotas de ácido acético al 20% hasta coloración rosa. Dejar reposar durante 4 horas a la temperatura ambiente. Diluir hasta 20 ml con agua destilada (PA), y centrifugar 10 minutos a 1.400 g. Mediante un dispositivo de succión, decantar el líquido límpido sobrenadante. Lavar las paredes del tubo de centrifugación (sin remover el depósito de calcio oxalato) utilizando 5 ml de solución de amonio hidróxido diluido siguiendo el segundo paso expuesto en el apartado correspondiente (reactivos necesarios). Centrifugar 5 minutos a 1.400 g, decantar el líquido sobrenadante mediante el dispositivo de succión, y realizar tres lavados sucesivos.
4.Valoración del oxalato: Después de haber extraído el agua del último lavado mediante el uso del sifón, se añaden 2 ml de solución acuosa de ácido sulfúrico, y 5 ml de agua destilada sobre el precipitado de calcio oxalato. Poner el tubo en baño de agua hirviendo y, una vez que el oxalato esté completamente disuelto, se procede a valorar con solución de potasio permanganato 0,02 N, hasta conseguir una coloración rosa persistente, manteniendo la temperatura durante la valoración por encima de los 60 ºC.
5.Ensayo en blanco: Efectuar un ensayo en blanco con todos los reactivos descritos, excepto que se sustituye la muestra de leche por 20 ml de agua destilada (PA).
Expresión de los resultados.
El contenido de calcio en la leche se calcula mediante las fórmulas siguientes:
Contenido en calcio (en %) = 0,0004 x (V - v) x K x 1.000/ P = 0,4 x (V - v) x K/ P
teniendo en cuenta la siguiente nomenclatura:
V = volumen en ml de MnO4K (0,02 N) gastados en la valoración de la muestra.
v = volumen en ml de MnO4K (0,02 N) gastados en el ensayo en blanco.
P = peso en gramos de la muestra inicial (alrededor de 20 g).
K = coeficiente de corrección del volumen del precipitado resultante de la precipitación tricoloroacética. Según el tipo de leche analizada este coeficiente tiene distintos valores numéricos:
K = 0,972, para muestras de leche entera (de 3,5 a 4,5% de materia grasa).
K = 0,976, para leche con 3% de grasa.
K = 0,980, para leche con 2% de grasa.
K = 0,985, para leche con 1% de grasa.
K = 0,989, para leche desnatada.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente o una inmediatamente después de otra por el mismo analista, no debe ser mayor de 0,002 g de calcio por 100 g de leche.
Referencias.
Principios y fundamentos metodológicos.
Se entiende por contenido en calcio de la leche la cantidad total de calcio, expresada en porcentaje en peso, y determinada por el procedimiento expuesto a continuación, que corresponde a la norma FIL-36: 1966 de la Federación Internacional de Lechería (FIL). Este método se aplica a todas las leches líquidas normales, así como a las leches reconstituidas por dilución o disolución de leches concentradas o de leches desecadas.
El calcio total presente en la muestra se lleva a disolución por precipitación de las materias proteicas de la leche mediante el ácido tricloroacéico, el calcio contenido en el filtrado es precipitado bajo forma de calcio oxalato, que se separa por centrifugación y se valora con potasio permanganato.
Material y aparatos utilizados.
-Balanza analítica.
-Matraz aforado de 50 ml.
-Pipeta para leche de 20 ml.
-Papell de filtro sin cenizas para filtración lenta.
-Centrífuga que pueda desarrollar una aceleración de 1.400 g (aceleración de la gravedad).
-Tubos de centrífuga, cilíndricos, con fondo redondo de 30 ml, aproximadamente, y marcados a 20 ml.
-Pipetas de 2 y 5 ml.
-Dispositivo de sifón por succión, provisto de un tubo capilar.
-Baño de agua, a temperatura de ebullición.
-Bureta graduada.
Reactivos necesarios.
-Ácido acético glacial (PA).
Ácido sulfúrico al 96% (PA).
-Ácido tricloroacético solución al 20% (p/v).
-Agua destilada (PA).
-Alcohol etílico del 96% (v/v).
-Amonio hidróxido al 25% (en NH3).
-Amonio oxalato 1-hidrato (PA).
-Potasio permanganato 0,05 N.
-Rojo de metilo, indicador de pH.
Todos los reactivos deben de ser puros para el análisis (PA).
Se utiliza el ácido tricloroacético en solución al 20% (p/v), o bien se prepara a partir del ácido tricloroacético en solución acuosa al 12% (p/v), usando el ácido tricloroacético en solución al 20% (p/v), y se diluye convenientemente.
El amonio oxalato 1-hidrato (PA) se prepara en solución acuosa saturada en frío.
El rojo de metilo se prepara en una solución al 0,05% (p/v) en alcohol etílico al 96% (v/v).
El ácido acético se usa en una solución acuosa al 20% (v/v), a partir de ácido acético glacial (PA), y diluyendo convenientemente.
En cuanto al empleo del amonio hidróxido, en primer lugar, se prepara en una solución acuosa obtenida mezclando volúmenes iguales de amonio hidróxido al 25% (en NH3) y de agua destilada (PA). Y posteriormente, se diluye esta solución acuosa a partir de 2 ml de amonio hidróxido al 25% con agua destilada hasta alcanzar un volumen de 100 ml.
El ácido sulfúrico al 96% se prepara en una solución acuosa añadiendo 20 ml de ácido sulfúrico del 96% (PA) a 80 ml de agua destilada (PA).
Para preparar el potasio permanganato 0,02 N se introducen, en un matraz aforado de 250 ml, un volumen de 100 ml de potasio permanganato 0,05 N; a continuación, se diluye y se enrasa con agua destilada (PA), determinándose finalmente el factor de la solución 0,02 N resultante.
Procedimiento analítico.
1.Preparación de la muestra: Antes del análisis, atemperar la muestra a 20 ± 2 ºC, y mezclar con cuidado; en el caso de no obtenerse una dispersión homogénea de la materia grasa, se recomienda calentar lentamente la muestra a 40 ºC, mezclar suavemente y dejar enfriar a 20 ± 2 ºC.
2.Defecación de la muestra: En un matraz aforado de 50 ml pesar exactamente alrededor de 20 g de leche, con una aproximación de 10 mg. Añadir poco a poco mientras se agita una solución acuosa de ácido tricloroacético al 20% (p/v), completando con este reactivo hasta los 50 ml. Agitar fuertemente durante algunos segundos, y dejar reposar 30 minutos. Filtrar sobre papel de filtro sin cenizas. El filtrado obtenido debe ser límpido.
3.Precipitación del calcio en forma de oxalato y separación del oxalato: En un tubo de centrífuga cilíndrica, de fondo redondo, se introducen 5 ml del filtrado límpido, y seguidamente 5 ml de ácido tricloroacético al 12%, 2 ml de una solución acuosa saturada de amonio oxalato 1-hidrato (PA), 2 gotas de solución alcohólica de rojo de metilo, y 2 ml de ácido acético al 20%. Mezclar mediante agitación circular y añadir poco a poco solución de amonio hidróxido al 25% (en NH3) hasta conseguir una coloración amarillo pálido; después, se añaden algunas gotas de ácido acético al 20% hasta coloración rosa. Dejar reposar durante 4 horas a la temperatura ambiente. Diluir hasta 20 ml con agua destilada (PA), y centrifugar 10 minutos a 1.400 g. Mediante un dispositivo de succión, decantar el líquido límpido sobrenadante. Lavar las paredes del tubo de centrifugación (sin remover el depósito de calcio oxalato) utilizando 5 ml de solución de amonio hidróxido diluido siguiendo el segundo paso expuesto en el apartado correspondiente (reactivos necesarios). Centrifugar 5 minutos a 1.400 g, decantar el líquido sobrenadante mediante el dispositivo de succión, y realizar tres lavados sucesivos.
4.Valoración del oxalato: Después de haber extraído el agua del último lavado mediante el uso del sifón, se añaden 2 ml de solución acuosa de ácido sulfúrico, y 5 ml de agua destilada sobre el precipitado de calcio oxalato. Poner el tubo en baño de agua hirviendo y, una vez que el oxalato esté completamente disuelto, se procede a valorar con solución de potasio permanganato 0,02 N, hasta conseguir una coloración rosa persistente, manteniendo la temperatura durante la valoración por encima de los 60 ºC.
5.Ensayo en blanco: Efectuar un ensayo en blanco con todos los reactivos descritos, excepto que se sustituye la muestra de leche por 20 ml de agua destilada (PA).
Expresión de los resultados.
El contenido de calcio en la leche se calcula mediante las fórmulas siguientes:
Contenido en calcio (en %) = 0,0004 x (V - v) x K x 1.000/ P = 0,4 x (V - v) x K/ P
teniendo en cuenta la siguiente nomenclatura:
V = volumen en ml de MnO4K (0,02 N) gastados en la valoración de la muestra.
v = volumen en ml de MnO4K (0,02 N) gastados en el ensayo en blanco.
P = peso en gramos de la muestra inicial (alrededor de 20 g).
K = coeficiente de corrección del volumen del precipitado resultante de la precipitación tricoloroacética. Según el tipo de leche analizada este coeficiente tiene distintos valores numéricos:
K = 0,972, para muestras de leche entera (de 3,5 a 4,5% de materia grasa).
K = 0,976, para leche con 3% de grasa.
K = 0,980, para leche con 2% de grasa.
K = 0,985, para leche con 1% de grasa.
K = 0,989, para leche desnatada.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente o una inmediatamente después de otra por el mismo analista, no debe ser mayor de 0,002 g de calcio por 100 g de leche.
Referencias.
-Norma Internacional FIL-IDF 36: 1966.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.
José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)
