Continuando con las técnicas oficiales de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación de la presencia sustancias proteicas reductoras en la leche.
Principios y fundamentos metodológicos.
Determinación de las sustancias proteicas reductoras de la leche, mediante reacción con potasio ferricianuro, y posterior valoración colorimétrica. Este método es aplicable a la detección de leche en polvo reconstituida en leche cruda o pasterizada.
Material y aparatos utilizados.
-Espectrofotómetro que permite lecturas de 610 nm con cubetas de 1 cm.
-Centrífuga a 1000-1500 revoluciones por minuto (r.p.m.).
-Tubos de centrífuga graduados a 50 ml.
-Baño de agua de temperatura regulable hasta 80 ºC.
Reactivos necesarios.
-Ácido acético glacial (PA).
-Ácido tricloroacético (PA).
-Agua destilada (PA).
-Hierro III cloruro 6-hidrato.
-Potasio biftalato (PA).
-Potasio ferricianuro (PA).
-Potasio ferrocianuro 3-hidrato(PA).
-Sodio hidróxido al 97%, en lentejas (PA).
-Urea (PA).
La solución de ácido Acético al 5% se prepara diluyendo 50 ml de ácido acético glacial (PA) con agua destilada (PA) hasta alcanzar un volumen de 1 litro.
Se prepara una solución saturada de urea (PA) con agua destilada (PA).
Para preparar la solución tampón se disuelven 2 g de sodio hidróxido (PA) en agua destilada hasta un volumen de 250 ml; a continuación, hay que disolver 10,2 g de potasio biftalato (PA) en agua destilada hasta 250 ml. Seguidamente, mezclar 150 ml de la solución de sodio hidróxido (PA) con 200 ml de la solución de potasio biftalato (PA), diluyendo hasta 800 ml, y ajustar la solución final a un valor de pH de 5,6, mediante la adición de las soluciones de sodio hidróxido o potasio biftalato.
La solución de potasio ferricianuro (PA) al 1% se prepara disolviendo 10 g de potasio ferricianuro (PA) en agua destilada (PA) hasta un volumen de 1 litro. Esta solución no debe utilizarse si presenta un color verde o contiene un precipitado azul, y únicamente deberá utilizarse recién preparada.
Para la solución de ácido tricloroacético al 10% hay que disolver 100 g de ácido tricloroacético (PA) en agua destilada (PA) y alcanzar un volumen de 1 litro.
En la preparación de la solución de hierro III cloruro 6-hidrato al 0,1%, se disuelven 0,1 g de hierro III cloruro 6-hidrato (PRS) en agua destilada (PA), hasta obtener a 100 ml, debiéndose utilizarse esta solución recién preparada.
En la solución de potasio ferrocianuro de 0,05 mg/ml se pesan 0,1147 g de potasio ferrocianuro 3-hidrato (PA), y se diluye con agua destilada (PA) hasta un volumen de 1 litro. En un matraz aforado se diluyen 50 ml de esta solución hasta obtener 100 ml, de modo que cada ml contiene 0,05 mg de potasio ferrocianuro anhidro; debido a que este reactivo se oxida fácilmente con el aire se debe utilizar inmediatamente después de su preparación.
Procedimiento analítico.
1.Preparación de la curva de referencia: Se colocan en los tubos de ensayo, los siguientes volúmenes de la solución de potasio ferrocianuro (0.05 mg/ml), medidos con pipeta: 0.5; 1.0; 1.5; 2.0; 2.5; 3.0; 3.5; 4.0 ml, dejando un tubo sin solución (0.0); a continuación, se añade agua destilada (PA) hasta alcanzar un volumen total de 5 ml.
Asimismo, a todos los tubos de ensayo se les añade 5 ml de la “solución blanco” preparada como se describe a continuación: Diluir 3 ml de la solución de urea (PA) en 15 ml con agua destilada (PA), en un tubo de centrífuga, añadir 5 ml de la solución tampón, 5 ml de la solución de potasio ferricianuro y 5 ml de la solución de ácido tricloroacético. Mezclar bien con una varilla de vidrio. Para hacer la curva de referencia, no hay que calentar ni filtrar la “solución blanco”; sin embargo, a la hora de analizar las muestras, la "solución blanco" se calienta y se filtra igual que en las condiciones del ensayo. A intervalos convenientes, añadir 1 ml de la solución de hierro III cloruro al 0,1%, para desarrollar el color, después hay que agitar y dejar en reposo exactamente durante 10 minutos. Ajustar el 100% de transmitancia con la solución control (tubo de 0,0 ml) de disolución de potasio ferrocianuro a 610 nm. Leer, a continuación, en transmitancia las distintas preparaciones de las soluciones patrones y representar los valores obtenidos frente a concentraciones en mg de potasio ferrocianuro en papel de escala semilogarítmica. Finalmente, preparar la curva de referencia con cada serie de análisis.
2.Determinación del parámetro composicional: Mantener las muestras aproximadamente a 3 ºC; las muestras congeladas o conservadas son inadecuadas para la determinación. Pipetar 15 ml de la muestra previamente homogeneizada en un tubo de centrífuga graduado de 50 ml, que contenga 15 ml de agua destilada (PA). Añadir 3 ml de la solución de ácido acético al 5%, agitar bien con una varilla de vidrio, y centrifugar durante 5 minutos. Decantar el líquido sobrenadante. Puede suceder que una pequeña proporción del precipitado quede flotando en la parte superior del tubo después de centrifugar; en el caso de que la mayor parte del precipitado permanezca en el fondo del tubo, entonces no se tendrá en cuenta en el procedimiento. Sin embargo, si la muestra contiene una cantidad excesiva de nata, el precipitado flotará y no podrá separarse el sobrenadante, por lo que hay que anular esta determinación y volver a mezclar la muestra completamente. Seguidamente, se lava el precipitado dos veces con volúmenes de 15 ml de agua destilada (PA), mezclando cada vez el precipitado con una varilla de vidrio, centrifugar 15 minutos y decantar. Tanto al precipitado como a un tubo de centrífuga limpio que se llevará paralelamente como "blanco", se añaden 3 ml de solución de urea y se diluyen hasta 15 ml con agua destilada (PA). A continuación, hay que agitar, añadir 5 ml de solución tampón y 5 ml de la solución de potasio ferrocianuro al 1%, agitando nuevamente, y colocar en un baño de agua a 70 ºC, exactamente 20 minutos y enfriar en hielo. Una vez enfriada, añadir 5 ml de la solución de ácido tricloroacético al 10%, agitar, y filtrar a través de un papel Whatman nº 40 de 11 cm o similar. Usar los primeros 5 ml del filtrado para lavar las paredes y el fondo del recipiente, eliminándolos. Verter el resto de la solución sobre el filtro y dejar que se filtre completamente; en el caso de que el filtrado sea turbio, hay que filtrarlo nuevamente. Introducir 5 ml de agua destilada (PA) en un tubo de ensayo, y añadir 5 ml del filtrado claro; posteriormente, se añade 1 ml de la solución de hierro III cloruro al 0,1% para que se desarrolle el color, se agita y se deja en reposo exactamente 10 minutos. Ajustar el 100% de transmitancia a 610 nm con el "blanco" y efectuar la lectura. Con las series de muestras, añadir la solución de hierro III cloruro a intervalos adecuados para permitir las lecturas después del período de 10 minutos.
Expresión de los resultados.
A partir de la curva de referencia, determinar la cantidad de sustancias reductoras, expresada como miligramos de potasio ferrocianuro por 100 mililitros de leche, multiplicando el valor obtenido de la curva por 40.
Observaciones.
Los análisis deben terminarse el mismo día que se comiencen; es muy importante que las muestras no permanezcan almacenadas demasiado tiempo después de su enfriamiento o después de la filtración. Asimismo, durante la determinación el laboratorio debe estar libre de vapores oxidantes o reductores (H2S, CL2, NH3, etc.).
Referencias.
-Official Methods of Analysis of the AOAC. Ed. 1975, Nº 16.047-16.050.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.
Principios y fundamentos metodológicos.
Determinación de las sustancias proteicas reductoras de la leche, mediante reacción con potasio ferricianuro, y posterior valoración colorimétrica. Este método es aplicable a la detección de leche en polvo reconstituida en leche cruda o pasterizada.
Material y aparatos utilizados.
-Espectrofotómetro que permite lecturas de 610 nm con cubetas de 1 cm.
-Centrífuga a 1000-1500 revoluciones por minuto (r.p.m.).
-Tubos de centrífuga graduados a 50 ml.
-Baño de agua de temperatura regulable hasta 80 ºC.
Reactivos necesarios.
-Ácido acético glacial (PA).
-Ácido tricloroacético (PA).
-Agua destilada (PA).
-Hierro III cloruro 6-hidrato.
-Potasio biftalato (PA).
-Potasio ferricianuro (PA).
-Potasio ferrocianuro 3-hidrato(PA).
-Sodio hidróxido al 97%, en lentejas (PA).
-Urea (PA).
La solución de ácido Acético al 5% se prepara diluyendo 50 ml de ácido acético glacial (PA) con agua destilada (PA) hasta alcanzar un volumen de 1 litro.
Se prepara una solución saturada de urea (PA) con agua destilada (PA).
Para preparar la solución tampón se disuelven 2 g de sodio hidróxido (PA) en agua destilada hasta un volumen de 250 ml; a continuación, hay que disolver 10,2 g de potasio biftalato (PA) en agua destilada hasta 250 ml. Seguidamente, mezclar 150 ml de la solución de sodio hidróxido (PA) con 200 ml de la solución de potasio biftalato (PA), diluyendo hasta 800 ml, y ajustar la solución final a un valor de pH de 5,6, mediante la adición de las soluciones de sodio hidróxido o potasio biftalato.
La solución de potasio ferricianuro (PA) al 1% se prepara disolviendo 10 g de potasio ferricianuro (PA) en agua destilada (PA) hasta un volumen de 1 litro. Esta solución no debe utilizarse si presenta un color verde o contiene un precipitado azul, y únicamente deberá utilizarse recién preparada.
Para la solución de ácido tricloroacético al 10% hay que disolver 100 g de ácido tricloroacético (PA) en agua destilada (PA) y alcanzar un volumen de 1 litro.
En la preparación de la solución de hierro III cloruro 6-hidrato al 0,1%, se disuelven 0,1 g de hierro III cloruro 6-hidrato (PRS) en agua destilada (PA), hasta obtener a 100 ml, debiéndose utilizarse esta solución recién preparada.
En la solución de potasio ferrocianuro de 0,05 mg/ml se pesan 0,1147 g de potasio ferrocianuro 3-hidrato (PA), y se diluye con agua destilada (PA) hasta un volumen de 1 litro. En un matraz aforado se diluyen 50 ml de esta solución hasta obtener 100 ml, de modo que cada ml contiene 0,05 mg de potasio ferrocianuro anhidro; debido a que este reactivo se oxida fácilmente con el aire se debe utilizar inmediatamente después de su preparación.
Procedimiento analítico.
1.Preparación de la curva de referencia: Se colocan en los tubos de ensayo, los siguientes volúmenes de la solución de potasio ferrocianuro (0.05 mg/ml), medidos con pipeta: 0.5; 1.0; 1.5; 2.0; 2.5; 3.0; 3.5; 4.0 ml, dejando un tubo sin solución (0.0); a continuación, se añade agua destilada (PA) hasta alcanzar un volumen total de 5 ml.
Asimismo, a todos los tubos de ensayo se les añade 5 ml de la “solución blanco” preparada como se describe a continuación: Diluir 3 ml de la solución de urea (PA) en 15 ml con agua destilada (PA), en un tubo de centrífuga, añadir 5 ml de la solución tampón, 5 ml de la solución de potasio ferricianuro y 5 ml de la solución de ácido tricloroacético. Mezclar bien con una varilla de vidrio. Para hacer la curva de referencia, no hay que calentar ni filtrar la “solución blanco”; sin embargo, a la hora de analizar las muestras, la "solución blanco" se calienta y se filtra igual que en las condiciones del ensayo. A intervalos convenientes, añadir 1 ml de la solución de hierro III cloruro al 0,1%, para desarrollar el color, después hay que agitar y dejar en reposo exactamente durante 10 minutos. Ajustar el 100% de transmitancia con la solución control (tubo de 0,0 ml) de disolución de potasio ferrocianuro a 610 nm. Leer, a continuación, en transmitancia las distintas preparaciones de las soluciones patrones y representar los valores obtenidos frente a concentraciones en mg de potasio ferrocianuro en papel de escala semilogarítmica. Finalmente, preparar la curva de referencia con cada serie de análisis.
2.Determinación del parámetro composicional: Mantener las muestras aproximadamente a 3 ºC; las muestras congeladas o conservadas son inadecuadas para la determinación. Pipetar 15 ml de la muestra previamente homogeneizada en un tubo de centrífuga graduado de 50 ml, que contenga 15 ml de agua destilada (PA). Añadir 3 ml de la solución de ácido acético al 5%, agitar bien con una varilla de vidrio, y centrifugar durante 5 minutos. Decantar el líquido sobrenadante. Puede suceder que una pequeña proporción del precipitado quede flotando en la parte superior del tubo después de centrifugar; en el caso de que la mayor parte del precipitado permanezca en el fondo del tubo, entonces no se tendrá en cuenta en el procedimiento. Sin embargo, si la muestra contiene una cantidad excesiva de nata, el precipitado flotará y no podrá separarse el sobrenadante, por lo que hay que anular esta determinación y volver a mezclar la muestra completamente. Seguidamente, se lava el precipitado dos veces con volúmenes de 15 ml de agua destilada (PA), mezclando cada vez el precipitado con una varilla de vidrio, centrifugar 15 minutos y decantar. Tanto al precipitado como a un tubo de centrífuga limpio que se llevará paralelamente como "blanco", se añaden 3 ml de solución de urea y se diluyen hasta 15 ml con agua destilada (PA). A continuación, hay que agitar, añadir 5 ml de solución tampón y 5 ml de la solución de potasio ferrocianuro al 1%, agitando nuevamente, y colocar en un baño de agua a 70 ºC, exactamente 20 minutos y enfriar en hielo. Una vez enfriada, añadir 5 ml de la solución de ácido tricloroacético al 10%, agitar, y filtrar a través de un papel Whatman nº 40 de 11 cm o similar. Usar los primeros 5 ml del filtrado para lavar las paredes y el fondo del recipiente, eliminándolos. Verter el resto de la solución sobre el filtro y dejar que se filtre completamente; en el caso de que el filtrado sea turbio, hay que filtrarlo nuevamente. Introducir 5 ml de agua destilada (PA) en un tubo de ensayo, y añadir 5 ml del filtrado claro; posteriormente, se añade 1 ml de la solución de hierro III cloruro al 0,1% para que se desarrolle el color, se agita y se deja en reposo exactamente 10 minutos. Ajustar el 100% de transmitancia a 610 nm con el "blanco" y efectuar la lectura. Con las series de muestras, añadir la solución de hierro III cloruro a intervalos adecuados para permitir las lecturas después del período de 10 minutos.
Expresión de los resultados.
A partir de la curva de referencia, determinar la cantidad de sustancias reductoras, expresada como miligramos de potasio ferrocianuro por 100 mililitros de leche, multiplicando el valor obtenido de la curva por 40.
Observaciones.
Los análisis deben terminarse el mismo día que se comiencen; es muy importante que las muestras no permanezcan almacenadas demasiado tiempo después de su enfriamiento o después de la filtración. Asimismo, durante la determinación el laboratorio debe estar libre de vapores oxidantes o reductores (H2S, CL2, NH3, etc.).
Referencias.
-Official Methods of Analysis of the AOAC. Ed. 1975, Nº 16.047-16.050.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.
José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)
