Continuando con los métodos oficiales de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación del contenido de fósforo en la leche.
Principios y fundamentos metodológicos.
Se entiende por contenido en fósforo en leche la cantidad total de fósforo, expresada en porcentaje en peso, determinada por el procedimiento expuesto a continuación, y que corresponde a la norma FIL-42: 1967, de la Federación Internacional de Lechería (FIL). Este método se aplica a todas las leches líquidas normales, así como a las leches reconstituidas por dilución o disolución de las leches concentradas o de las leches desecadas.
Las materias orgánicas de la leche se destruyen por un proceso de mineralización en seco (incineración), y el fósforo se determina colorimétricamente, reduciendo el amonio fosfomolibdato con diaminofenol (amidol), y midiendo la densidad óptica de la solución obtenida.
Material y aparatos utilizados.
-Balanza analítica.
-Cápsulas de platino o de cuarzo, de 55 mm de diámetro aproximadamente, y provistas de vidrio de reloj.
-Baño de agua.
-Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml.
-Matraces aforados, de 25 ml con tapones esmerilados, de 100 y de 1.000 ml.
-Horno mufla.
-Estufa a 105 ± 2 ºC.
-Espectrofotocolorímetro.
Reactivos necesarios.
-Ácido clorhídrico 1 N.
-Ácido perclórico al 70% (PA).
-Agua destilada (PA).
-Amonio molibdato 4-hidrato (PA).
-2,4-diaminofenol diclorohidrato (amidol).
-Potasio fosfato mono-básico (PA).
-Sodio meta-bisulfito (PA).
El ácido perclórico se prepara partiendo de este reactivo al 65% (d = 1,61), o usando el ácido perclórico al 70%, y diluyendo convenientemente.
La solución de amidol se hace disolviendo, en agua destilada (PA), 1 g de 2,4-diaminofenol diclorohidrato ((NH2)2C6H3OH.2HCl), y 20 g de sodio meta-bisulfito (PA), o de sodio pirosulfito (Na2S2O5), y completar hasta 100 ml en un matraz aforado con tapón esmerilado. Se recomienda preparar una solución nueva cada día.
Para la solución de molibdato se disuelven en agua destilada (PA), 8,3 g de amonio molibdato 4-hidrato ((NH4)6Mo7O24.4H2O, completando hasta un volumen de 100 ml.
En el caso de la solución acuosa de potasio fosfato mono-básico (PA), se prepara a partir de este reactivo (KH2PO4), desecado durante 2 horas a 105 ºC, lo cual permite trazar una curva de referencia para la determinación del fósforo. Para ello, hay que pesar 4,393 g de potasio fosfato mono-básico (PA), después se disuelve en agua destilada (PA), completando hasta 1.000 ml (solución A). Seguidamente se diluyen 10 ml de solución A hasta completar 1.000 ml (solución B)., teniendo en cuenta que: 1 mililitro de solución B = 10 microgramos de fósforo (P).
Todos los reactivos utilizados en esta técnica analítica deben ser puros para el análisis (PA).
Procedimiento analítico.
1.Preparación de la muestra: Antes del análisis hay que atemperar la muestra a 20 ± 2 ºC y mezclar cuidadosamente; en el caso de no obtener una dispersión homogénea de la materia grasa, hay que calentar lentamente la muestra a 40 ºC, agitando suavemente y luego, enfriar a 20 ± 2 ºC.
2.Ensayo en blanco: Efectuar un ensayo en blanco usando todos los reactivos, del mismo modo que se procede en la técnica detallada en el siguiente apartado 3.3 (determinación colorimétrica del fósforo), con la excepción de que se reemplazan los 5 ml de la dilución por 5 ml de agua destilada (PA).
3.Determinación del parámetro composicional: Hay que realizar las cuatro operaciones siguientes:
3.1.Mineralización por vía seca: En una cápsula de platino o de cuarzo pesar exactamente alrededor de 10 g de leche con una aproximación de 10 mg. Evaporar, hasta sequedad, en el baño de agua hirviendo; después de conseguir la desecación completa, hay que calcinar la muestra en la mufla a una temperatura comprendida entre 500 ºC y 550 ºC hasta la obtención de cenizas blancas.
3.2.Preparación de la solución de cenizas: Después de enfriar la cápsula, cubrirla con un vidrio de reloj, disolver las cenizas en 2 o 3 ml de ácido clorhídrico 1 N, y diluir con agua destilada (PA). Trasvasar la solución de las cenizas a un matraz aforado de 100 ml, lavar el vidrio de reloj y la cápsula, recogiendo las aguas de lavado en el matraz. Completar hasta 100 ml con agua destilada (PA), agitar y filtrar. A continuación, se extraen 10 ml del filtrado, y se introducen en un matraz de 100 ml, completándose con agua destilada y agitar.
3.3.Determinación colorimétrica del fósforo: Se miden 5 ml de de la dilución preparada en el apartado 3.2. (preparación de la solución de cenizas), y se introducen en un matraz aforado de 25 ml. Seguidamente, añadir sucesivamente 2 ml de ácido perclórico, 2 ml de la solución de amidol, y 1 ml de la solución de amonio molibdato. Completar hasta 25 ml con agua destilada (PA) y mezclar. Esperar 5 minutos y medir la densidad óptica utilizando una cubeta de 1 cm en un espectrofotocolorímetro a 750 nanómetros. Buscar en la curva patrón la cantidad de fósforo contenida en el matraz de 25 ml, expresada en microgramos, correspondiente a la densidad óptica leída.
3.4.Determinación de la curva patrón: En cuatro matraces aforados de 25 ml hay que introducir 3, 5, 7 y 10 ml de la solución B, de modo que estas cantidades así introducidas son iguales a 30, 50, 70 y 100 microgramos de fósforo. Y a continuación, se procede igual que en el apartado 3.3. Seguidamente, se trasladan a una gráfica las diversas densidades ópticas obtenidas en función de las cantidades de fósforo presentes en los matraces, y finalmente, se procede a trazar la curva patrón (que es una recta).
Expresión de los resultados.
El contenido en fósforo de la leche, expresada en g de fósforo por 100 g de leche, viene dado por la fórmula siguiente:
Contenido en fósforo (en %) = (m - m')/ 50 x M
teniendo en cuenta la siguiente nomenclatura:
m = masa de fósforo, expresada en microgramos, obtenida según el apartado 3.4., y contenida en el matraz de 25 ml con la muestra de 50 mg de leche (aproximadamente).
m' = masa de fósforo, expresada en microgramos, obtenida según el apartado 3.4., y contenida en el ensayo en blanco.
M = masa de leche, expresada en gramos, empleada para la mineralización.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente, o una inmediatamente después de otra, por el mismo analista, no debe ser mayor de 0.008 g de fósforo por 100 g de leche.
Referencias.
Principios y fundamentos metodológicos.
Se entiende por contenido en fósforo en leche la cantidad total de fósforo, expresada en porcentaje en peso, determinada por el procedimiento expuesto a continuación, y que corresponde a la norma FIL-42: 1967, de la Federación Internacional de Lechería (FIL). Este método se aplica a todas las leches líquidas normales, así como a las leches reconstituidas por dilución o disolución de las leches concentradas o de las leches desecadas.
Las materias orgánicas de la leche se destruyen por un proceso de mineralización en seco (incineración), y el fósforo se determina colorimétricamente, reduciendo el amonio fosfomolibdato con diaminofenol (amidol), y midiendo la densidad óptica de la solución obtenida.
Material y aparatos utilizados.
-Balanza analítica.
-Cápsulas de platino o de cuarzo, de 55 mm de diámetro aproximadamente, y provistas de vidrio de reloj.
-Baño de agua.
-Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml.
-Matraces aforados, de 25 ml con tapones esmerilados, de 100 y de 1.000 ml.
-Horno mufla.
-Estufa a 105 ± 2 ºC.
-Espectrofotocolorímetro.
Reactivos necesarios.
-Ácido clorhídrico 1 N.
-Ácido perclórico al 70% (PA).
-Agua destilada (PA).
-Amonio molibdato 4-hidrato (PA).
-2,4-diaminofenol diclorohidrato (amidol).
-Potasio fosfato mono-básico (PA).
-Sodio meta-bisulfito (PA).
El ácido perclórico se prepara partiendo de este reactivo al 65% (d = 1,61), o usando el ácido perclórico al 70%, y diluyendo convenientemente.
La solución de amidol se hace disolviendo, en agua destilada (PA), 1 g de 2,4-diaminofenol diclorohidrato ((NH2)2C6H3OH.2HCl), y 20 g de sodio meta-bisulfito (PA), o de sodio pirosulfito (Na2S2O5), y completar hasta 100 ml en un matraz aforado con tapón esmerilado. Se recomienda preparar una solución nueva cada día.
Para la solución de molibdato se disuelven en agua destilada (PA), 8,3 g de amonio molibdato 4-hidrato ((NH4)6Mo7O24.4H2O, completando hasta un volumen de 100 ml.
En el caso de la solución acuosa de potasio fosfato mono-básico (PA), se prepara a partir de este reactivo (KH2PO4), desecado durante 2 horas a 105 ºC, lo cual permite trazar una curva de referencia para la determinación del fósforo. Para ello, hay que pesar 4,393 g de potasio fosfato mono-básico (PA), después se disuelve en agua destilada (PA), completando hasta 1.000 ml (solución A). Seguidamente se diluyen 10 ml de solución A hasta completar 1.000 ml (solución B)., teniendo en cuenta que: 1 mililitro de solución B = 10 microgramos de fósforo (P).
Todos los reactivos utilizados en esta técnica analítica deben ser puros para el análisis (PA).
Procedimiento analítico.
1.Preparación de la muestra: Antes del análisis hay que atemperar la muestra a 20 ± 2 ºC y mezclar cuidadosamente; en el caso de no obtener una dispersión homogénea de la materia grasa, hay que calentar lentamente la muestra a 40 ºC, agitando suavemente y luego, enfriar a 20 ± 2 ºC.
2.Ensayo en blanco: Efectuar un ensayo en blanco usando todos los reactivos, del mismo modo que se procede en la técnica detallada en el siguiente apartado 3.3 (determinación colorimétrica del fósforo), con la excepción de que se reemplazan los 5 ml de la dilución por 5 ml de agua destilada (PA).
3.Determinación del parámetro composicional: Hay que realizar las cuatro operaciones siguientes:
3.1.Mineralización por vía seca: En una cápsula de platino o de cuarzo pesar exactamente alrededor de 10 g de leche con una aproximación de 10 mg. Evaporar, hasta sequedad, en el baño de agua hirviendo; después de conseguir la desecación completa, hay que calcinar la muestra en la mufla a una temperatura comprendida entre 500 ºC y 550 ºC hasta la obtención de cenizas blancas.
3.2.Preparación de la solución de cenizas: Después de enfriar la cápsula, cubrirla con un vidrio de reloj, disolver las cenizas en 2 o 3 ml de ácido clorhídrico 1 N, y diluir con agua destilada (PA). Trasvasar la solución de las cenizas a un matraz aforado de 100 ml, lavar el vidrio de reloj y la cápsula, recogiendo las aguas de lavado en el matraz. Completar hasta 100 ml con agua destilada (PA), agitar y filtrar. A continuación, se extraen 10 ml del filtrado, y se introducen en un matraz de 100 ml, completándose con agua destilada y agitar.
3.3.Determinación colorimétrica del fósforo: Se miden 5 ml de de la dilución preparada en el apartado 3.2. (preparación de la solución de cenizas), y se introducen en un matraz aforado de 25 ml. Seguidamente, añadir sucesivamente 2 ml de ácido perclórico, 2 ml de la solución de amidol, y 1 ml de la solución de amonio molibdato. Completar hasta 25 ml con agua destilada (PA) y mezclar. Esperar 5 minutos y medir la densidad óptica utilizando una cubeta de 1 cm en un espectrofotocolorímetro a 750 nanómetros. Buscar en la curva patrón la cantidad de fósforo contenida en el matraz de 25 ml, expresada en microgramos, correspondiente a la densidad óptica leída.
3.4.Determinación de la curva patrón: En cuatro matraces aforados de 25 ml hay que introducir 3, 5, 7 y 10 ml de la solución B, de modo que estas cantidades así introducidas son iguales a 30, 50, 70 y 100 microgramos de fósforo. Y a continuación, se procede igual que en el apartado 3.3. Seguidamente, se trasladan a una gráfica las diversas densidades ópticas obtenidas en función de las cantidades de fósforo presentes en los matraces, y finalmente, se procede a trazar la curva patrón (que es una recta).
Expresión de los resultados.
El contenido en fósforo de la leche, expresada en g de fósforo por 100 g de leche, viene dado por la fórmula siguiente:
Contenido en fósforo (en %) = (m - m')/ 50 x M
teniendo en cuenta la siguiente nomenclatura:
m = masa de fósforo, expresada en microgramos, obtenida según el apartado 3.4., y contenida en el matraz de 25 ml con la muestra de 50 mg de leche (aproximadamente).
m' = masa de fósforo, expresada en microgramos, obtenida según el apartado 3.4., y contenida en el ensayo en blanco.
M = masa de leche, expresada en gramos, empleada para la mineralización.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente, o una inmediatamente después de otra, por el mismo analista, no debe ser mayor de 0.008 g de fósforo por 100 g de leche.
Referencias.
-Norma Internacional FIL-IDF 42: 1967.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.
José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)
