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jueves, 8 de octubre de 2015

INVESTIGACIÓN: MANIPULACIÓN SEMEN OVINO (ESPAÑA)

En un trabajo de investigación se ha realizado un estudio comparativo de los efectos de las técnicas de manipulación de semen ovino Rasa Aragonesa sobre el nivel apoptótico, según los distintos métodos de lavado utilizados.

La eficiente preparación de esperma para su uso en reproducción asistida en ganado ovino, requiere acumular el mayor número de espermatozoides mótiles, viables y morfológicamente normales en un volumen de semen relativamente pequeño. Además, debe permitir la obtención de una muestra libre de plasma seminal. En este sentido, los métodos de eliminación de plasma, como el lavado en colchón de sacarosa y la filtración, así como los de selección de espermatozoides con mejor viabilidad y motilidad, Percoll y swim-up, se emplean para eliminar el posible efecto deletéreo de las sustancias presentes en el plasma, incorporar sustancias protectoras del esperma o bien enriquecer las fracciones en espermatozoides viables, para ser utilizados en técnicas como IVF e ISCI. Estas técnicas pueden producir cambios en la viabilidad, motilidad, velocidad y potencial de fertilización, debido parcialmente a las alteraciones que afectan la integridad de la membrana espermática.

En el presente estudio se muestran los efectos de las técnicas de manipulación de semen más frecuentemente empleadas sobre la viabilidad celular, estado de capacitación y el desarrollo apoptótico (translocación de Fosfatidilserina-PS, y actividad de las caspasas 3 y 7). Se utilizó semen ovino obtenido a partir de moruecos de raza Rasa Aragonesa pertenecientes a ANGRA, realizándose extracciones semanales, con períodos de abstinencia de dos o tres días.

Se analizaron todos los parámetros indicados en el resumen en muestras frescas, seleccionadas mediante “swim-up”, diluidas (en el mismo mHTF empleado para el swim-up) y mantenidas en estufa a 37ºC durante el tiempo que duró el swim-up, seleccionadas mediante gradiente de Percoll, muestras lavadas en colchón de sacarosa, y semen filtrado. Para realizar la filtración, se tomó semen completo y se diluyó en medio de bifase; a continuación se filtró mediante un equipo de filtración a vacío Millipore. Cuando quedaba un mililitro se volvió a diluir en medio de bifase a una dilución de 1:10 y finalmente se recogió 1 ml de la suspensión de células. Para el estudio de viabilidad se tiñeron las muestras con 6-CFDA y PI.

Para el estudio del estado de capacitación, se realizó la tinción con CTC y se evaluó de acuerdo a lo descrito en la bibliografía. El estudio de translocación de la PS se realizó mediante doble tinción de las células, en suspensión en un tampón de unión (Sigma), con 6-CFDA y Annexina V-Cy3.18. La Annexina V se une a la PS externalizada en la membrana como etapa inicial de la cascada de eventos de la apoptosis. La determinación de actividad de las caspasas 3 y 7 se realizó conjuntamente puesto que reconocen la misma secuencia de aminoácidos (DEVD). Las diferentes muestras espermáticas se lavaron con PBS centrifugando 15 min a 30000xg a 4ºC y el sedimento obtenido se congeló a -80 ºC. Los sedimentos se resuspendieron con un tampón de lisis (200 mM Tris, pH 7,5, 2 M NaCl, 20 mM EDTA, 0,2% Tritón X-100) y se electoporaron para la extracción total del contenido celular, evitando así la degradación de las caspasas. La suspensión obtenida se centrifugó (5 min a 11300xg) y el sobrenadante se congeló a -80 ºC hasta su análisis mediante el EnzChek Caspase-3 Assay kit (Molecular Probes).

Del análisis de los resultados obtenidos se observa que las muestras seleccionadas mediante swim-up presentaron el mejor porcentaje de recuperación de células viables respecto del semen inicial sin procesar (incremento del 10%), mientras que el resto de métodos de lavado y selección mostraron una reducción de la viabilidad de la dosis. La pérdida de viabilidad observada en el control podría deberse a la acción del plasma durante la incubación, que junto con el hecho de que no se produce selección espermática podrían ser las causas de la pérdida de calidad de casi un 6%. El gradiente de Percoll debería proporcionar un incremento del número de espermatozoides viables, sin embargo, la centrifugación realizada podría ser la causa del daño producido a las células y de la disminución de la viabilidad (20%).

Los métodos de eliminación de plasma mediante lavado en colchón de sacarosa y la filtración, también parecen provocar un daño en las células, si bien el primero parece ser menos dañino que la filtración produciendo una disminución de la viabilidad del 4% frente al 8%, respectivamente. Del estudio de tinción con CTC se obtuvieron resultados semejantes. Las muestras seleccionadas mediante swim-up presentaron un incremento considerable en el número de espermatozoides no capacitados recuperados (incremento del 55%), mientras en el resto de muestras estudiadas presentaban un mayor porcentaje de espermatozoides capacitados, 54% en muestras de Percoll, 23% en colchón de sacarosa y 56% en filtración. La muestra control mantenida en la estufa presentó mayor proporción de células reaccionadas (un 28% más) que la inicial.

Estos resultados muestran claramente la ventaja de la utilización del método de swim-up, frente a las otras metodologías ensayadas. Asimismo, sugieren la posible existencia, en el plasma seminal, de “elementos disparo” de la apoptosis, lo que explicaría el mayor porcentaje de células no viables en las muestras con plasma seminal. Para comprobar si los resultados observados en cuanto a calidad espermática coincidían con el nivel apoptótico de la muestra se analizaron etapas iniciales de la apoptosis (mediante la actividad de caspasas efectoras y translocación de PS). En cuanto a la actividad de caspasas efectoras estudiadas (3 y 7), las muestras de swim-up, colchón de sacarosa y filtración mostraron un 36% menos de actividad que la muestra fresca. El análisis de los resultados de translocación de PS reveló un menor porcentaje de espermatozoides apoptóticos en muestras seleccionadas mediante swim-up (18%).

Se observó un pequeño incremento en el caso del lavado en colchón de sacarosa (1%), lo que podría deberse al daño que provoca la centrifugación. La muestra de semen filtrado no presentó variación respecto a la muestra inicial, sin embargo sí que se observó actividad caspasa, aunque 37% menor que la muestra inicial. Las muestras obtenidas mediante gradiente de Percoll no mostraron actividad caspasa. Sin embargo, sí se encontraron espermatozoides con PS externalizada, aunque en menor porcentaje que la muestra inicial (5%). Esto podría deberse a que los espermatozoides hayan sufrido apoptosis y estén en las etapas finales de dicho proceso, de forma que ya no estén presentes las caspasas de una forma activa, o bien a que el desarrollo del método, que incluye la centrifugación, provoque en las células una desestabilización total de la membrana de forma que la PS esté presente en la membrana externa.

Por último, el porcentaje de espermatozoides apoptóticos fue menor (17%) en la muestra control mantenida en la estufa que en la muestra inicial, pero su actividad caspasa era mayor que la de la muestra fresca (22%). Esto puede deberse al efecto perjudicial que ejerce el plasma sobre las células, de modo que en el momento del análisis los espermatozoides estarían en las primeras etapas de apoptosis, actuando las caspasas efectoras.

De los resultados obtenidos se puede concluir que el método de swim-up/ dextrano es el más adecuado, en las condiciones estudiadas, para la eliminación del plasma y selección de espermatozoides ovinos con buenos parámetros de viabilidad, estado de capacitación y nivel apoptótico.


Autoría: E. Martí y colaboradores (2005)
José Luis Ares Cea (recopilación científica)

miércoles, 7 de octubre de 2015

INVESTIGACIÓN: EVALUACIÓN MACHOS CAPRINO DE CANARIAS (ESPAÑA)

En un trabajo de investigación se han evaluado tres métodos para la estimación del tamaño testicular en machos jóvenes de las razas caprinas Majorera, Tinerfeña, y Palmera (Canarias, España).

El tamaño testicular puede ser utilizado en la especie caprina como un predictor del inicio de la pubertad, y también como indicador de la cantidad de semen producido al estar relacionado con la producción espermática. Si bien existen varios métodos para la evaluación del volumen testicular, en este trabajo se ha realizado una evaluación comparativa de tres sistemas sencillos, con el objetivo de conocer su aplicación en las razas caprinas de Canarias.

En el presente estudio se utilizaron 24 machos distribuidos en dos lotes (n=12), con 4 individuos por lote de cada una de las tres razas (Majorera, Palmera y Tinerfeña). El experimento se inició en el mes de abril, cuando los animales contaban con 4,5 meses de vida (63,5 días), y un peso medio de 15,30±1,96 kg para el lote 1 y 24,14±2,38 kg para el lote 2. Cuando los machos cumplieron 13 meses de vida se finalizó la experiencia. El diámetro testicular derecho se obtuvo con un calibrador por el sistema descrito a partir del diámetro máximo antero-posterior, deduciéndose el espesor del pliegue escrotal. La circunferencia escrotal se obtuvo con una cinta métrica flexible, en el punto donde ambos testículos mostraron el diámetro mayor. El volumen testicular se halló a partir de un orquidiómetro por la comparación del testículo derecho. La correlación de las variables de las medidas testiculares se realizó con los coeficientes de Pearson en el programa estadístico SPSS V.12.

Analizando los resultados obtenidos se observa una mayor dispersión de los datos en los animales con menor peso corporal (lote 1). El tamaño testicular fue menor en el lote de animales de menor peso vivo (lote 1) que en los animales más pesados (lote 2), salvo en el caso de la raza tinerfeña, lo que se puede atribuir a factores individuales. En cuanto a las correlaciones entre las medidas obtenidas para el lote de machos de mayor peso inicial (lote 2), para los de menor peso (lote 1), así como para el número total de observaciones, muestran los mismos niveles de significación (p<0,001) para los tres métodos evaluados para cada raza y lote, lo que permite utilizarlos indistintamente.


Autoría: J. Sicilia Alonso y colaboradores (2005)
José Luis Ares Cea (recopilación científica)

miércoles, 29 de julio de 2015

INVESTIGACIÓN: EVALUACIÓN DE SEMENTALES DE RAZA MURCIANO-GRANADINA (ESPAÑA)

En un trabajo de investigación se ha estudiado la evolución de los parámetros seminales (concentración y volumen), así como la evaluación de futuros sementales a través de pruebas de progenie en una población de machos cabríos de raza Murciano-Granadina en la Comunidad Valenciana (España).

El presente trabajo se ha realizado ante la necesidad de un adecuado entrenamiento para los machos cabríos del Programa de selección de esta raza, con la finalidad de mejorar la recuperación del semen de los cabritos seleccionados, hijos de las mejores hembras de la cabaña evaluadas intrarrebaño. Así mismo, era también necesario definir los parámetros reproductivos de los machos de dicha raza; estos parámetros están ligados, por una parte, al manejo de los animales y, por otra, a sus propias aptitudes. La buena conjunción de ambas permite optimizar el proceso de recogida, logrando obtener unos tiempos de recuperación mínimos con eyaculados de mejor calidad.

Se ha estudiado una población de 13 machos de la raza Murciano-Granadina pertenecientes a la Asociación de Ganaderos de Caprino de la Raza Murciano-Granadina de la Comunidad Valenciana (AMURVAL) integrada en el seno de ACRIMUR. Estos machos llegaban al Centro de Investigación y Tecnología Animal (CITA-IVIA) a una edad aproximada de 5 meses. Una vez adaptados, fueron sometidos a un programa de entrenamiento para su adecuación a la vagina artificial. Para la recogida de semen se siguieron las pautas descritas en el protocolo de Silvestre y colaboradores (2004). A la edad de ocho meses se procedió a presentarlos ante una hembra estrogenizada sujeta a un potro de monta. El pase fue individual, si bien se hizo en presencia del resto de los animales. El tiempo máximo que permanecían con la hembra era de 10 minutos, en el caso de que no eyacularan. Si eyaculaban se retiraban inmediatamente del recinto. Las vaginas artificiales lubricadas en el extremo anterior, fueron atemperadas con agua, a una temperatura de 45 ºC. La presión en el interior era regulada de tal forma que permitiera el libre desplazamiento de una varilla de vidrio de 6 milímetros de diámetro. Las recuperaciones fueron realizadas siempre por el mismo operario, con la misma cadencia y la misma rutina de trabajo con respecto al grupo. Se evitaron en todo momento situaciones estresantes. En la información recogida se registró si los animales montaban o no, si la monta era acompañada de eyaculación y, cuando ésta se producía finalmente, se registraban las medias del volumen (en mililitros) y la concentración del semen (x 10-6) para estudiar su evolución a lo largo de la edad de los machos.

Entre los resultados obtenidos se consideraron como montas efectivas aquellas en las que se obtuvieron eyaculados, aunque su volumen fuera mínimo. A partir del tercer mes de entrenamiento y con una media de edad de 10 meses se recogía el semen a la mayoría de los futuros sementales (85% de los machos en testaje). En otros centros de inseminación, también se empieza aproximadamente a la misma edad y son eliminados aproximadamente el 15% de animales que no se adaptan a la vagina en las 15 primeras oportunidades, con dos sesiones de recogida a la semana. En este estudio, se correspondería aproximadamente con la edad de 11 meses, en la que un 15% de los machos no montaban todavía.

En el caso de la producción de semen, se podría optar por eliminar aquellos machos que no superasen una media de volumen de 0,2 ml o una concentración de mil millones de espermatozoides por ml, según algunos autores. De seguir este criterio, deberían eliminarse los machos 18, 19 y 20; sin embargo, podría ser más lógico establecer un mínimo en la producción total de espermatozoides (STP x 106) por macho y por eyaculado, puesto que es el término determinante para la producción de dosis, siendo deseable desde el punto de vista práctico superar al menos una STP de 1000 × 106 por eyaculado, manteniendo los mínimos establecidos de volumen y concentración. Combinando un mínimo de volumen y de producción se eliminarían 5 machos del centro (25%).


Autoría: J. Bernácer y colaboradores (2005)
José Luis Ares Cea (recopilación científica)

martes, 30 de junio de 2015

INVESTIGACIÓN: COMPORTAMIENTO SEXUAL MACHOS CABRÍOS RAZA MURCIANO-GRANADINA (ESPAÑA)

En un trabajo de investigación se ha estudiado, durante tres años, el comportamiento sexual de machos cabríos de raza Murciano-Granadina en cuanto a la producción de semen y los parámetros de calidad (volumen de eyaculado y concentración espermática) para su empleo en inseminación artificial en el Centro de Recogida de Esperma de Hinojosa del Duque (Córdoba, España). 

El ganado caprino constituye una de las más antiguas especies domésticas, existiendo datos de su domesticación hacia el año 7000 a.C., lo que ha supuesto un control del ser humano, entre otros, del manejo de la reproducción. Los caprinos están presentes prácticamente en todo el mundo y constituyen un recurso importante de numerosos países. Sin embargo, los datos acerca de su comportamiento sexual (tiempo de reacción) son mucho más limitados que para los bovinos o los ovinos. El comportamiento sexual presenta pues, un interés evidente para mejorar la rentabilidad del ganado caprino, siendo esto aplicable igualmente cuando los sistemas usados sean inseminación artificial, fecundación in vitro o transferencia de embrionesSe producen importantes variaciones en el comportamiento sexual del macho, dependiendo de la existencia de un grupo de machos, de condiciones ambientales (sobre todo la estacionalidad) o bien de factores individuales (edad, estado fisiológico, etc.).

La metodología utilizada consistió en evaluar la libido y la valoración seminal de 9 sementales murciano-granadinos, inscritos en el libro genealógico de la raza, con el objeto de estudiar la influencia de los factores ambientales y la estacionalidad sobre el comportamiento del macho en monta sobre vagina artificial. Se han utilizado 1130 muestras de eyaculados, obtenidos en dos montas semanales desde el 1 de abril del año 2002 hasta el 21 de abril de 2005. Durante este tiempo se han delimitado dos periodos diferenciados: uno inicial en el que el efecto lumínico ha venido dado por la insolación solar natural del momento, y un segundo periodo en que se ha realizado un fotoperiodo artificial con un sistema de iluminación eléctrica.

Los machos ingresaron en el Centro de Testaje con 4-5 meses de edad, realizándose los pertinentes controles sanitarios. Deben adaptarse a la monta sobre vagina artificial, anotándose en una ficha: el operario, tiempo de reacción, el volumen de eyaculado y el color de eyaculado. Se han obtenido los datos de 9 machos durante un año completo, desde el 1 de abril de 2002 hasta el 21 de abril de 2003. Para valorar la conducta de los machos se han obtenido los siguientes datos en cada monta:
-Tiempo de reacción del macho. Es el tiempo valorado en segundos, desde que el macho tiene contacto visual con la cabra recela, hasta que eyacula.
-Volumen eyaculado. Volumen total del eyaculado valorado en mililitros.
-Concentración espermática. Valorada en miles de millones de espermatozoides/mililitro.
La recogida de datos se ha realizado con la siguiente sistemática:
-Los valores de tiempo de reacción, se obtienen con un reloj temporizador ubicado en la sala de extracciones de semen.
-Los valores de volumen de semen se obtienen por pesada del tubo colector en una balanza, con una precisión de hasta 0,01 g.
-La concentración espermática, se mide en un fotómetro Acucell, diluyendo una muestra de 50 microlitros de semen en 9.950 mililitros de solución salina formolada.
En cuanto al alojamiento de los machos, están en una nave distribuidos en boxes individuales. La nave permite un cerramiento tal que se puede aplicar un fotoperiodo artificial con luces eléctricas en periodos alternos de dos meses de días largos (16 horas de luz) y días cortos (8 horas de luz).

Los resultados obtenidos revelan que la estacionalidad y la edad son factores significativos (ANOVA factorial), determinantes de la variabilidad anual de los parámetros seminales y libido, sin fotoperiodo. Asimismo, se ha puesto de manifiesto que el fotoperiodo es un elemento necesario para conseguir uniformizar los parámetros seminales a lo largo del año, máxime para un Centro de inseminación, que realiza la mayor parte de las inseminaciones artificiales fuera de la estación sexual de las cabras.


Autoría: F. A. Arrebola y colaboradores (2005)
José Luis Ares Cea (recopilación científica)

INVESTIGACIÓN: EVALUACIÓN DE SEMENTALES CAPRINO MURCIANO-GRANADINA (ESPAÑA)

En un trabajo de investigación se ha estudiado la evolución de los parámetros seminales para la evaluación de futuros sementales cabríos de raza Murciano-Granadina mediante pruebas de progenie en rebaños de la Comunidad Valenciana (España).

Dentro del desarrollo del esquema nacional de mejora genética de la raza caprina Murciano- Granadina (Programa de Selección) en la Comunidad Valenciana, se estableció la necesidad de un adecuado entrenamiento para la recuperación del semen de los cabritos seleccionados, hijos de las mejores hembras de la cabaña evaluadas intrarrebaño. También debían definirse los parámetros reproductivos de los machos de esta raza para su permanencia en el Centro (CITA-IVIA). Estos parámetros están ligados, por una parte, al manejo de los animales y, por otra, a sus propias aptitudes. La buena conjunción de ambas permite optimizar el proceso de recogida, logrando obtener unos tiempos de recuperación mínimos con eyaculados de mejor calidad.

Se ha estudiado una población de 13 machos pertenecientes a la Asociación de Ganaderos de Caprino de la Raza Murciano-Granadina de la Comunidad Valenciana (AMURVAL) en el seno de ACRIMUR. Estos machos llegaban al Centro de Investigación y Tecnología Animal (CITA-IVIA) a una edad aproximada de 5 meses. Una vez adaptados, fueron sometidos a un programa de entrenamiento para su adecuación a la vagina artificial. A la edad de ocho meses se procedió a presentarlos ante una hembra estrogenizada sujeta a un potro de monta. El pase fue individual, si bien en presencia del resto de los animales. El tiempo máximo que permanecían con la hembra era de 10 minutos, en el caso de que no eyacularan. Si eyaculaban se retiraban inmediatamente del recinto. Las vaginas artificiales lubricadas en el extremo anterior, fueron atemperadas con agua, a una temperatura de 45 ºC. La presión en el interior era regulada de tal forma que permitiera el libre desplazamiento de una varilla de vidrio de 6 milímetros de diámetro. Las recuperaciones fueron realizadas siempre por el mismo operario, con la misma cadencia y la misma rutina de trabajo con respecto al grupo. Se evitaron en todo momento situaciones estresantes. Se registró si los animales montaban o no, si la monta era acompañada de eyaculación y, si ésta se producía finalmente, se registraba el volumen y la concentración para estudiar su evolución a lo largo de la edad de los machos.

En los resultados obtenidos se consideraron como montas efectivas aquellas en las que se obtuvieron eyaculados, aunque su volumen fuera mínimo. A partir del tercer mes de entrenamiento y con una media de edad de 10 meses se recogía el semen a la mayoría de los futuros sementales (85% de los machos en testaje). En otros centros de inseminación, también se empieza aproximadamente a la misma edad y son eliminados aproximadamente el 15% de animales que no se adaptan a la vagina en las 15 primeras oportunidades, con dos sesiones de recogida a la semana. En este estudio, se correspondería aproximadamente con la edad de 11 meses, en la que un 15% de los machos no montaban todavía.

En el caso de la producción de semen, aunque se podrían eliminar aquellos machos que no superasen una media de volumen de 0,2 ml o una concentración de mil millones de espermatozoides por ml, de acuerdo con este criterio, se eliminarían los machos 18, 19 y 20; sin embargo, podría ser más lógico establecer un mínimo en la producción total de espermatozoides (STP), puesto que es el término determinante para la producción de dosis, siendo deseable desde el punto de vista práctico superar al menos una STP de 1000 × 106 por eyaculado, manteniendo los mínimos establecidos de volumen y concentración. En este sentido, combinando un mínimo de volumen y de producción eliminaríamos 5 machos del centro (25%).



Autoría: J. Bernácer y colaboradores (2005)
José Luis Ares Cea (recopilación científica)