En un trabajo de investigación se ha realizado un estudio comparativo de los efectos de las técnicas de manipulación de semen ovino Rasa Aragonesa sobre el nivel apoptótico, según los distintos métodos de lavado utilizados.
La eficiente preparación de esperma para su uso en reproducción asistida en ganado ovino, requiere acumular el mayor número de espermatozoides mótiles, viables y morfológicamente normales en un volumen de semen relativamente pequeño. Además, debe permitir la obtención de una muestra libre de plasma seminal. En este sentido, los métodos de eliminación de plasma, como el lavado en colchón de sacarosa y la filtración, así como los de selección de espermatozoides con mejor viabilidad y motilidad, Percoll y swim-up, se emplean para eliminar el posible efecto deletéreo de las sustancias presentes en el plasma, incorporar sustancias protectoras del esperma o bien enriquecer las fracciones en espermatozoides viables, para ser utilizados en técnicas como IVF e ISCI. Estas técnicas pueden producir cambios en la viabilidad, motilidad, velocidad y potencial de fertilización, debido parcialmente a las alteraciones que afectan la integridad de la membrana espermática.
En el presente estudio se muestran los efectos de las técnicas de manipulación de semen más frecuentemente empleadas sobre la viabilidad celular, estado de capacitación y el desarrollo apoptótico (translocación de Fosfatidilserina-PS, y actividad de las caspasas 3 y 7). Se utilizó semen ovino obtenido a partir de moruecos de raza Rasa Aragonesa pertenecientes a ANGRA, realizándose extracciones semanales, con períodos de abstinencia de dos o tres días.
Se analizaron todos los parámetros indicados en el resumen en muestras frescas, seleccionadas mediante “swim-up”, diluidas (en el mismo mHTF empleado para el swim-up) y mantenidas en estufa a 37ºC durante el tiempo que duró el swim-up, seleccionadas mediante gradiente de Percoll, muestras lavadas en colchón de sacarosa, y semen filtrado. Para realizar la filtración, se tomó semen completo y se diluyó en medio de bifase; a continuación se filtró mediante un equipo de filtración a vacío Millipore. Cuando quedaba un mililitro se volvió a diluir en medio de bifase a una dilución de 1:10 y finalmente se recogió 1 ml de la suspensión de células. Para el estudio de viabilidad se tiñeron las muestras con 6-CFDA y PI.
Para el estudio del estado de capacitación, se realizó la tinción con CTC y se evaluó de acuerdo a lo descrito en la bibliografía. El estudio de translocación de la PS se realizó mediante doble tinción de las células, en suspensión en un tampón de unión (Sigma), con 6-CFDA y Annexina V-Cy3.18. La Annexina V se une a la PS externalizada en la membrana como etapa inicial de la cascada de eventos de la apoptosis. La determinación de actividad de las caspasas 3 y 7 se realizó conjuntamente puesto que reconocen la misma secuencia de aminoácidos (DEVD). Las diferentes muestras espermáticas se lavaron con PBS centrifugando 15 min a 30000xg a 4ºC y el sedimento obtenido se congeló a -80 ºC. Los sedimentos se resuspendieron con un tampón de lisis (200 mM Tris, pH 7,5, 2 M NaCl, 20 mM EDTA, 0,2% Tritón X-100) y se electoporaron para la extracción total del contenido celular, evitando así la degradación de las caspasas. La suspensión obtenida se centrifugó (5 min a 11300xg) y el sobrenadante se congeló a -80 ºC hasta su análisis mediante el EnzChek Caspase-3 Assay kit (Molecular Probes).
Del análisis de los resultados obtenidos se observa que las muestras seleccionadas mediante swim-up presentaron el mejor porcentaje de recuperación de células viables respecto del semen inicial sin procesar (incremento del 10%), mientras que el resto de métodos de lavado y selección mostraron una reducción de la viabilidad de la dosis. La pérdida de viabilidad observada en el control podría deberse a la acción del plasma durante la incubación, que junto con el hecho de que no se produce selección espermática podrían ser las causas de la pérdida de calidad de casi un 6%. El gradiente de Percoll debería proporcionar un incremento del número de espermatozoides viables, sin embargo, la centrifugación realizada podría ser la causa del daño producido a las células y de la disminución de la viabilidad (20%).
Los métodos de eliminación de plasma mediante lavado en colchón de sacarosa y la filtración, también parecen provocar un daño en las células, si bien el primero parece ser menos dañino que la filtración produciendo una disminución de la viabilidad del 4% frente al 8%, respectivamente. Del estudio de tinción con CTC se obtuvieron resultados semejantes. Las muestras seleccionadas mediante swim-up presentaron un incremento considerable en el número de espermatozoides no capacitados recuperados (incremento del 55%), mientras en el resto de muestras estudiadas presentaban un mayor porcentaje de espermatozoides capacitados, 54% en muestras de Percoll, 23% en colchón de sacarosa y 56% en filtración. La muestra control mantenida en la estufa presentó mayor proporción de células reaccionadas (un 28% más) que la inicial.
Estos resultados muestran claramente la ventaja de la utilización del método de swim-up, frente a las otras metodologías ensayadas. Asimismo, sugieren la posible existencia, en el plasma seminal, de “elementos disparo” de la apoptosis, lo que explicaría el mayor porcentaje de células no viables en las muestras con plasma seminal. Para comprobar si los resultados observados en cuanto a calidad espermática coincidían con el nivel apoptótico de la muestra se analizaron etapas iniciales de la apoptosis (mediante la actividad de caspasas efectoras y translocación de PS). En cuanto a la actividad de caspasas efectoras estudiadas (3 y 7), las muestras de swim-up, colchón de sacarosa y filtración mostraron un 36% menos de actividad que la muestra fresca. El análisis de los resultados de translocación de PS reveló un menor porcentaje de espermatozoides apoptóticos en muestras seleccionadas mediante swim-up (18%).
Se observó un pequeño incremento en el caso del lavado en colchón de sacarosa (1%), lo que podría deberse al daño que provoca la centrifugación. La muestra de semen filtrado no presentó variación respecto a la muestra inicial, sin embargo sí que se observó actividad caspasa, aunque 37% menor que la muestra inicial. Las muestras obtenidas mediante gradiente de Percoll no mostraron actividad caspasa. Sin embargo, sí se encontraron espermatozoides con PS externalizada, aunque en menor porcentaje que la muestra inicial (5%). Esto podría deberse a que los espermatozoides hayan sufrido apoptosis y estén en las etapas finales de dicho proceso, de forma que ya no estén presentes las caspasas de una forma activa, o bien a que el desarrollo del método, que incluye la centrifugación, provoque en las células una desestabilización total de la membrana de forma que la PS esté presente en la membrana externa.
Por último, el porcentaje de espermatozoides apoptóticos fue menor (17%) en la muestra control mantenida en la estufa que en la muestra inicial, pero su actividad caspasa era mayor que la de la muestra fresca (22%). Esto puede deberse al efecto perjudicial que ejerce el plasma sobre las células, de modo que en el momento del análisis los espermatozoides estarían en las primeras etapas de apoptosis, actuando las caspasas efectoras.
De los resultados obtenidos se puede concluir que el método de swim-up/ dextrano es el más adecuado, en las condiciones estudiadas, para la eliminación del plasma y selección de espermatozoides ovinos con buenos parámetros de viabilidad, estado de capacitación y nivel apoptótico.
Autoría: E. Martí y colaboradores (2005)
José Luis Ares Cea (recopilación científica)
La eficiente preparación de esperma para su uso en reproducción asistida en ganado ovino, requiere acumular el mayor número de espermatozoides mótiles, viables y morfológicamente normales en un volumen de semen relativamente pequeño. Además, debe permitir la obtención de una muestra libre de plasma seminal. En este sentido, los métodos de eliminación de plasma, como el lavado en colchón de sacarosa y la filtración, así como los de selección de espermatozoides con mejor viabilidad y motilidad, Percoll y swim-up, se emplean para eliminar el posible efecto deletéreo de las sustancias presentes en el plasma, incorporar sustancias protectoras del esperma o bien enriquecer las fracciones en espermatozoides viables, para ser utilizados en técnicas como IVF e ISCI. Estas técnicas pueden producir cambios en la viabilidad, motilidad, velocidad y potencial de fertilización, debido parcialmente a las alteraciones que afectan la integridad de la membrana espermática.
En el presente estudio se muestran los efectos de las técnicas de manipulación de semen más frecuentemente empleadas sobre la viabilidad celular, estado de capacitación y el desarrollo apoptótico (translocación de Fosfatidilserina-PS, y actividad de las caspasas 3 y 7). Se utilizó semen ovino obtenido a partir de moruecos de raza Rasa Aragonesa pertenecientes a ANGRA, realizándose extracciones semanales, con períodos de abstinencia de dos o tres días.
Se analizaron todos los parámetros indicados en el resumen en muestras frescas, seleccionadas mediante “swim-up”, diluidas (en el mismo mHTF empleado para el swim-up) y mantenidas en estufa a 37ºC durante el tiempo que duró el swim-up, seleccionadas mediante gradiente de Percoll, muestras lavadas en colchón de sacarosa, y semen filtrado. Para realizar la filtración, se tomó semen completo y se diluyó en medio de bifase; a continuación se filtró mediante un equipo de filtración a vacío Millipore. Cuando quedaba un mililitro se volvió a diluir en medio de bifase a una dilución de 1:10 y finalmente se recogió 1 ml de la suspensión de células. Para el estudio de viabilidad se tiñeron las muestras con 6-CFDA y PI.
Para el estudio del estado de capacitación, se realizó la tinción con CTC y se evaluó de acuerdo a lo descrito en la bibliografía. El estudio de translocación de la PS se realizó mediante doble tinción de las células, en suspensión en un tampón de unión (Sigma), con 6-CFDA y Annexina V-Cy3.18. La Annexina V se une a la PS externalizada en la membrana como etapa inicial de la cascada de eventos de la apoptosis. La determinación de actividad de las caspasas 3 y 7 se realizó conjuntamente puesto que reconocen la misma secuencia de aminoácidos (DEVD). Las diferentes muestras espermáticas se lavaron con PBS centrifugando 15 min a 30000xg a 4ºC y el sedimento obtenido se congeló a -80 ºC. Los sedimentos se resuspendieron con un tampón de lisis (200 mM Tris, pH 7,5, 2 M NaCl, 20 mM EDTA, 0,2% Tritón X-100) y se electoporaron para la extracción total del contenido celular, evitando así la degradación de las caspasas. La suspensión obtenida se centrifugó (5 min a 11300xg) y el sobrenadante se congeló a -80 ºC hasta su análisis mediante el EnzChek Caspase-3 Assay kit (Molecular Probes).
Del análisis de los resultados obtenidos se observa que las muestras seleccionadas mediante swim-up presentaron el mejor porcentaje de recuperación de células viables respecto del semen inicial sin procesar (incremento del 10%), mientras que el resto de métodos de lavado y selección mostraron una reducción de la viabilidad de la dosis. La pérdida de viabilidad observada en el control podría deberse a la acción del plasma durante la incubación, que junto con el hecho de que no se produce selección espermática podrían ser las causas de la pérdida de calidad de casi un 6%. El gradiente de Percoll debería proporcionar un incremento del número de espermatozoides viables, sin embargo, la centrifugación realizada podría ser la causa del daño producido a las células y de la disminución de la viabilidad (20%).
Los métodos de eliminación de plasma mediante lavado en colchón de sacarosa y la filtración, también parecen provocar un daño en las células, si bien el primero parece ser menos dañino que la filtración produciendo una disminución de la viabilidad del 4% frente al 8%, respectivamente. Del estudio de tinción con CTC se obtuvieron resultados semejantes. Las muestras seleccionadas mediante swim-up presentaron un incremento considerable en el número de espermatozoides no capacitados recuperados (incremento del 55%), mientras en el resto de muestras estudiadas presentaban un mayor porcentaje de espermatozoides capacitados, 54% en muestras de Percoll, 23% en colchón de sacarosa y 56% en filtración. La muestra control mantenida en la estufa presentó mayor proporción de células reaccionadas (un 28% más) que la inicial.
Estos resultados muestran claramente la ventaja de la utilización del método de swim-up, frente a las otras metodologías ensayadas. Asimismo, sugieren la posible existencia, en el plasma seminal, de “elementos disparo” de la apoptosis, lo que explicaría el mayor porcentaje de células no viables en las muestras con plasma seminal. Para comprobar si los resultados observados en cuanto a calidad espermática coincidían con el nivel apoptótico de la muestra se analizaron etapas iniciales de la apoptosis (mediante la actividad de caspasas efectoras y translocación de PS). En cuanto a la actividad de caspasas efectoras estudiadas (3 y 7), las muestras de swim-up, colchón de sacarosa y filtración mostraron un 36% menos de actividad que la muestra fresca. El análisis de los resultados de translocación de PS reveló un menor porcentaje de espermatozoides apoptóticos en muestras seleccionadas mediante swim-up (18%).
Se observó un pequeño incremento en el caso del lavado en colchón de sacarosa (1%), lo que podría deberse al daño que provoca la centrifugación. La muestra de semen filtrado no presentó variación respecto a la muestra inicial, sin embargo sí que se observó actividad caspasa, aunque 37% menor que la muestra inicial. Las muestras obtenidas mediante gradiente de Percoll no mostraron actividad caspasa. Sin embargo, sí se encontraron espermatozoides con PS externalizada, aunque en menor porcentaje que la muestra inicial (5%). Esto podría deberse a que los espermatozoides hayan sufrido apoptosis y estén en las etapas finales de dicho proceso, de forma que ya no estén presentes las caspasas de una forma activa, o bien a que el desarrollo del método, que incluye la centrifugación, provoque en las células una desestabilización total de la membrana de forma que la PS esté presente en la membrana externa.
Por último, el porcentaje de espermatozoides apoptóticos fue menor (17%) en la muestra control mantenida en la estufa que en la muestra inicial, pero su actividad caspasa era mayor que la de la muestra fresca (22%). Esto puede deberse al efecto perjudicial que ejerce el plasma sobre las células, de modo que en el momento del análisis los espermatozoides estarían en las primeras etapas de apoptosis, actuando las caspasas efectoras.
De los resultados obtenidos se puede concluir que el método de swim-up/ dextrano es el más adecuado, en las condiciones estudiadas, para la eliminación del plasma y selección de espermatozoides ovinos con buenos parámetros de viabilidad, estado de capacitación y nivel apoptótico.
Autoría: E. Martí y colaboradores (2005)
José Luis Ares Cea (recopilación científica)
