LABORATORIO ÁCIDOS GRASOS VOLÁTILES SOLUBLES E INSOLUBLES EN MANTEQUILLA-1

Continuando con las técnicas de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación del índice de ácidos grasos volátiles solubles e insolubles en la mantequilla.

Principios y fundamentos metodológicos. 
El índice de ácidos grasos volátiles solubles o índice de Reichert o Reichert-Meissl-Mellny, es el número de mililitros de una solución acuosa de álcali 0,1 N, requeridos para neutralizar los ácidos grasos volátiles solubles en agua de una cantidad de 5 gramos de grasa en las condiciones que se especifica en esta metodología. 
El índice de ácidos grasos volátiles insolubles o índice de Polenske, es el número de mililitros de solución acuosa de álcali 0,1 N, requeridos para neutralizar los ácidos grasos volátiles insolubles en agua, obtenidos en una muestra de 5 gramos de grasa, en las condiciones del método. 
Después de saponificar la grasa con una solución de sodio hidróxido en glicerina, la solución jabonosa se diluye con agua y se acidifica con ácido sulfúrico. Los ácidos grasos volátiles se destilan y los ácidos grasos insolubles se separan de los solubles por filtración. La solución acuosa de ácidos solubles y la solución etanólica de ácidos insolubles se valoran separadamente con una solución de álcali normalizada. El método es empírico porque sólo determina una parte de estos ácidos; por tanto, los aparatos utilizados y las especificaciones referentes al procedimiento se deben seguir rigurosamente para obtener resultados exactos y reproducibles.

Material y aparatos utilizados.
-Aparato de destilación (en esquema adjunto): Está integrado por los siguientes elementos:
1.Matraz de fondo plano de vidrio al borosilicato de 300 ml de capacidad (A).
2.Cabeza de destilación (E).
3.Refrigerante ( C).
4.Receptor, es un matraz aforado con las rayas circulares de aforo a 100 y 110 ml (D).
5.Lámina de amianto o asbesto de 120 mm de diámetro, 6 mm de espesor con una abertura central circular de 40 a 50 mm de diámetro, para sostener el matraz durante el calentamiento (E).
6.Piedra pómez triturada que pasa a través de un tamiz de malla circular de 1,44 mm.

En la figura se representan las dimensiones en mm y el montaje del aparato de destilación; para las conexiones se puede utilizar tapones de caucho, neopreno o silicona, o juntas de vidrio esmerilado “estandar” 24/40.

Reactivos necesarios.
-Ácido sulfúrico 1 N (SV).
-Agua destilada (PA).
-Alcohol etílico al 96% (v/v, PA).
-Fenolftaleína en solución al 1% ( RE).
-Glicerina (PRS).
-Piedra pómez de 4-8 mm ( PR).
-Sodio hidróxido al 97% en lentejas (PA).
-Sodio hidróxido 0,1 N ( SV).
-Indicador de fenolftaleína.

La glicerina empleada tiene las siguientes características: d = 1,26; 98% (p/p).
Para preparar la solución acuosa de sodio hidróxido (44% p/p) se usa sodio hidróxido al 97% en lentejas (PA), y se disuelve en agua destilada (PA). Se recomienda su conservación en una botella protegida del dióxido de carbono, y utilizar siempre la porción limpia libre de precipitado de carbonatos.
El agua destilada (PA) que se utilice en este método debe hervirse durante 15 minutos, para eliminar el dióxido de carbono.
La solución acuosa de sodio hidróxido 0,1 N (SV) o potasio hidróxido 0,1 N, debe estar normalizada exactamente.
El alcohol etílico al 96% (v/v PA) debe ser neutro a la fenolftaleína; el agua usada debe ser destilada o de una pureza al menos equivalente.

Procedimiento analítico.
1.Preparación de la muestra: Fundir aproximadamente 50 g de la muestra de mantequilla en una estufa estándar a una temperatura inferior a 50 ºC, hasta conseguir la separación de las fases acuosa y grasa; seguidamente, hay que separar la capa de grasa por decantación, y clarificarla en la estufa a unos 40 ºC; después se filtra empleando un papel de filtro seco, evitando que pase la fase acuosa por el filtro. 
2.Determinación del índice de ácidos grasos volátiles solubles: Pesar 5 g de grasa en el matraz A, con una aproximación de 0,01 g; añadir 20 g (16 ml) de glicerina (PRS), y 2 ml de solución de sodio hidróxido (44%). Para añadir la solución de sodio hidróxido debe usarse una bureta protegida de la entrada de dióxido de carbono, limpiando previamente la punta de la bureta y desechando las primeras gotas. Calentar el matraz a fuego directo, evitando el sobrecalentamiento, y agitando continuamente hasta que el líquido no forme espuma y se vuelva límpido. Dejar enfriar el matraz hasta 90 ºC, añadir 90 ml de agua destilada (PA) recién hervida a la misma temperatura aproximadamente, y mezclar hasta que el líquido obtenido sea límpido. Añadir de 0,6 a 0,7 g de piedra pómez y 50 ml de solución de ácido sulfúrico 1 N (SV). Conectar inmediatamente el matraz al aparato de destilación calentando ligeramente hasta que los ácidos grasos libres formen una capa superficial limpia. En el calentamiento debe regularse la llama de modo que se recojan en el matraz aforado 110 ml de destilado en unos 19-21 minutos, considerándose el comienzo de la destilación el momento en que se forma la primera gota en el refrigerante. Se debe regular el flujo de agua del refrigerante de modo que se mantenga la temperatura del agua que sale del mismo a 20 ± 1 ºC. Una vez recogidos los 110 ml de destilado, quitar el mechero inmediatamente y sustituir el matraz aforado por un pequeño vaso. A continuación, mezclar el contenido del matraz aforado agitando suavemente, y sumergir el matraz en un baño de agua a 20 ± 1 ºC durante 10-15 minutos, quedando la señal correspondiente a los 110 ml del matraz aforado por debajo del nivel del agua del baño; se debe agitar el matraz en varias ocasiones. Tapar el matraz y mezclar invirtiéndolo 4 o 5 veces sin agitar. Filtrar los 110 ml de destilado a través de un papel de filtro seco de velocidad media (diámetro 80-90 mm), que se ajusta en un embudo. El filtrado debe ser límpido, empleando un filtro con las dimensiones adecuadas para que un volumen de 15 ml lo llene por completo. Pipetar 100 ml de filtrado y pasarlos a un matraz erlenmeyer de 300 ml, añadir 0,5 ml de la solución indicadora de fenolftaleína al 1% (RE), y valorar con la solución acuosa de álcali “estándar” 0,1 N hasta obtener un color rosa persistente durante 30-60 segundos.
3.Ensayo en blanco: Se realiza sin grasa, y en lugar de saponificar a fuego directo hay que calentar en baño de agua hirviendo durante 15 minutos. Para la valoración es suficiente con emplear 0,5 ml de la solución de álcali normalizada. En caso contrario, se deben preparar nuevas soluciones del reactivo.
4.Determinación del índice de ácidos grasos volátiles insolubles (Polenske): Previamente, se debe lavar el filtro con tres volúmenes sucesivos de 15 ml de agua destilada (PA) a la temperatura de 20 ± 1 ºC, una vez que hayan pasado cada uno a través del refrigerante del vaso pequeño y del matraz aforado. Colocar el embudo y el filtro en el cuello de un matraz cónico, limpio y seco, de 200 ml de capacidad. Disolver los ácidos grasos insolubles repitiendo los lavados, usando volúmenes de 15 ml de alcohol etílico de 96% (v/v, PA). Valorar con la solución acuosa de álcali normalizada (0,1 N) el conjunto de los lavados utilizando alcohol etílico de 96% (v/v, PA), y 0,5 ml de solución indicadora de fenolftaleína al 1% (RE), hasta un color rosa persistente durante 30-60 segundos.

Expresión de los resultados.
Los distintos resultados se obtienen mediante las siguientes fórmulas:
1.Índice de ácidos grasos volátiles solubles (índice de Reichert):

Índice de Reichert = 11. t . (V₁ – b)

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
V₁ = Volumen en mililitros de la solución normalizada (0,1 N) de álcali, utilizados en la valoración de la muestra.
b = Volumen en mililitros de la solución normalizada (0,1 N) de álcali, utilizados en el ensayo en blanco.
t = Normalidad exacta de la solución normalizada (0,1 N) de álcali. 

El resultado obtenido se redondea a la primera cifra decimal.

2.Índice de ácidos grasos volátiles insolubles (índice de Polenske): 

Índice de Polenske = 10 . t . V₂

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
V₂ = Volumen en mililitros de la solución normalizada (0,1 N) de álcali utilizada en la valoración de la muestra.
t = Normalidad exacta de la solución normalizada (0,1 N) de álcali.

Se debe redondear el resultado a la primera cifra decimal.

3.Reproducción de los resultados: La diferencia entre los resultados de dos determinaciones duplicadas, obtenidos simultáneamente o inmediatamente uno detrás de otro por el mismo analista, no debe exceder de 0,5 para el índice de Reichert o de 0,3 para el índice de Polenske.

Referencias.

-Métodos de análisis. Boletín Oficial del Estado (21/7/1977 y 22/7/1977).
-Norma Internacional FIL-IDF 37: 1966.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: ÁCIDOS GRASOS CADENA CORTA EN MANTEQUILLA-1

Continuando con las técnicas de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación de los ácidos grasos de cadena corta en la mantequilla.

Principios y fundamentos metodológicos. 
El fundamento del método es la obtención de los ésteres metílicos de los ácidos grasos mediante la reacción con una solución de potasio hidróxido en alcohol metílico y la consiguiente inyección de la disolución de los ésteres metílicos directamente en el cromatógrafo. Este método es aplicable a las grasas de mantequillas u otras que contengan ácidos grasos de longitud de cadena inferior al C₁₄ y siempre que el contenido en ácidos libres no exceda de 1% expresados en ácido oleico.

Material y aparatos utilizados.
-Matraces con boca esmerilada y fondo redondo de 50 y 100 ml de capacidad.
-Pipetas aforadas de 1, 2 y 10 ml.
-Matraces aforados de 50 y 100 ml de capacidad.
-Probeta graduada de 10 ml.
-Jeringa de características adecuadas para la inyección de la muestra, graduada en décimas de ml, con una capacidad total de 1 a 10 ml.
-Cromatógrafo apto para trabajar en fase gaseosa, provisto de horno capaz de ser calentado hasta 250-300 ºC y sistema de regulación que permita controlar la temperatura con un error de ± 1,0 ºC. Equipado con programador de temperatura capaz de llevar la temperatura del horno de 60 ºC a 180 ºC a una velocidad de 4 ºC/minuto, y provisto de regulación independiente de la temperatura del inyector, que podrá ser calentado a una temperatura superior al menos en 50 ºC a la máxima alcanzable por el horno provisto de un sistema de detección sensible, de ionización de llama de hidrógeno, que pueda ser mantenido a la temperatura de la columna, a unos 50 ºC por encima de la del horno.
-Registrador con una tensión de entrada adecuada a la salida del amplificador del cromatógrafo, con una velocidad de respuesta mínima capaz de producir la deflexión completa de la escala en un segundo; y una velocidad de desplazamiento del papel de 5mm/min, que permita la posibilidad de variar esta velocidad, acelerando o retardando el desplazamiento.
-Tubo de nitrógeno a presión, utilizable como gas portador, debiendo tener una riqueza mínima del 99,8%.
-Tubos de hidrógeno y aire a presión necesarios para el caso en que se utilice detector de llama de hidrógeno. El hidrógeno deberá tener una riqueza mínima del 99,8%, debiendo además estar seco. Como medida de seguridad, es muy conveniente colocar a la entrada de los gases en el cromatógrafo, sendos tubos de desecación, provistos de tamiz molecular 13X.
-Columna cromatográfica: 
1.Columna que satisfaga las condiciones que se indican en las observaciones (punto 1).
2.Columna de vidrio con diámetro interior de 4 mm y una longitud aproximada de 2 mm. Rellenada con Chromosorb G, W o Q (80-100 mallas), conteniendo de 2,5 a 5% de un poliéster; pudiendo utilizarse cualquiera de los tres siguientes: dietilenglicolsuccinato (DEGS), etilenglicolsuccinato (EGS) o etilenglicoladipato (EGA), y polietilenglicoladipato (PEGA). 
Antes de emplear una columna nueva en la resolución de problemas analíticos, debe ser acondicionada, eliminando todos aquellos productos volátiles que pertubarían la buena marcha de la cromatografía. Para ello, la columna se monta en el cromatógrafo, sin conectarla al detector, y se calienta el horno a unos 10 ºC por encima de la temperatura máxima a que vaya a ser utilizada dicha columna en trabajos posteriores; haciendo pasar al mismo tiempo, una corriente de nitrógeno de 30 a 40 ml/minuto, que se mantiene durante 24 horas como mínimo. La columna será apta para su utilización si, una vez conectada al detector y en funcionamiento normal, la línea base dibujada por el registrador acusa la estabilidad del sistema.

Reactivos necesarios.
-Alcohol metílico (PA).
-Éter de petróleo de 40-60 ºC (PA).
-n-heptano (PA).
-Potasio hidróxido al 85% en lentejas (PA).

El éter de petróleo n-hexano deben tener un contenido en benceno no superior a 0,1%, además de cumplir el resto de las especificaciones en ambos reactivos. 
En la preparación de la disolución de potasio hidróxido 2 N en alcohol metílico se disuelven 11,2 g de potasio hidróxido al 85% en lentejas (PA) en 100 ml de alcohol metílico.
Los éteres metílicos deben tener la pureza adecuada para poder ser utilizados como patrones en cromatografía gaseosa. Para ello, se dispondrá de los ésteres metílicos de los ácidos mencionados a continuación, debiendo tener una pureza mínima de 99%, determinada por cromatografía gaseosa:
Ácido butanoico (butírico).
Ácido pentanoico (valeriánico).
Ácido hexanoico (caproico).
Ácido octanoico (caprílico).
Ácido decanoico (cáprico).
Ácido dodecanoico (laúrico).
Ácido tetradecanoico (mirístico).
Ácido hexadecanoico (palmítico).
Ácido octadecanoico (esteárico).
Ácido 9-octadecanoico (oleico).
Ácido 9,12-octadecadienoico (linoléico).
Ácido sicosanoico (aráquico).

La solución de referencia I se prepara en un matraz aforado de 50 ml donde se pesa 1 g de metilo pentanoato, con una exactitud de ±0,1 mg, disolviéndolo en n-heptano (PA), y completando hasta el volumen de enrase.
La solución de Referencia II se prepara en un matraz aforado de 100 ml donde se pesan 200 g de metilo pentanoato, con una exactitud de ±0,1 mg, disolviéndolo en n-heptano (PA), y completando hasta el volumen de enrase.

Procedimiento analítico.
1.Preparación de los ésteres metílicos: En un matraz de fondo redondo de 50 ml, pesar 1 g de grasa, con exactitud de ±0,1 mg, añadiendo 10 ml de éter de petróleo 40-60 ºC (PRS) o n-hexano (PA), y agitar suavemente hasta disolución de la grasa. En el caso de que se quiera efectuar una determinación cuantitativa de los ácidos butírico y caproico en la muestra, hay que agregar a la disolución en éter de petróleo de la grasa, 1 ml de la solución de referencia más adecuada, medida exactamente. En el caso de que las muestras contengan de 1 a 4% de ácido butírico se utilizará la solución de referencia I; en cambio, si contienen menos de 1% de ácido butírico se emplea la solución de referencia II. Si se desea efectuar solamente un análisis completo de la fracción de ácidos grasos, para lo que se aplica el método de normalización interna, no será necesario el empleo de la solución de referencia. A la solución en éter de petróleo de la muestra, adicionada o no de solución de referencia, se debe agregar 0,5 ml de disolución de potasio hidróxido 2 N, agitando la muestra hasta que se ponga transparente, durante un tiempo aproximado de 20-30 segundos. Casi inmediatamente después de observar la clarificación de la solución suele apreciarse un ligero enturbiamiento debido a la separación de glicerol, que se sedimenta rápidamente. Nada más terminada la reacción y observada la sedimentación, hay que tomar la cantidad necesaria con la jeringa e inyectarla en el cromatógrafo; una demora en la inyección de los ésteres metílicos daría lugar a la formación de jabones, con el consiguiente error en la determinación analítica.
2.Determinación cromatográfica: 
2.1.Condiciones de trabajo: 
-Temperatura de la columna: Temperatura programada de 60 a 160 ºC con una velocidad de 4 ºC/minuto.
-Temperatura del inyector: 200 ºC.
-Temperatura del detector: 200 ºC.
-Gas Portador: Nitrógeno (o helio) con flujo de 60 ml/min.
-Flujo de hidrógeno y aire para la alimentación del detector: Los flujos dependerán del tipo de detector utilizado, debiendo determinarse previamente para optimizar la respuesta.
-El registro obtenido del cromatograma: Debe satisfacer las condiciones establecidas a continuación; en caso contrario, se debe repetir la inyección modificando la cantidad inyectada o la sensibilidad de trabajo hasta obtener un cromatograma satisfactorio. 
Los requisitos exigibles son los siguientes:
a) El área total descrita en el registro, referida a la sensibilidad máxima utilizada en el curso de la operación, debe ser aproximadamente de 2.000 mm² con una velocidad del papel en el registrador de 5mm/minuto. De esta forma, los componentes presentes en una cuantía de 0,1% deben dar un pico, como mínimo de 2 mm² , siendo, por tanto perfectamente reconocibles.
b) Con el fin de conseguir que todos los picos caigan dentro del papel registrador, se utilizará, en cada caso, la atenuación de sensibilidad que sea necesaria, cuidando que el pico de mayor intensidad no sea atenuado más de ocho veces. Una vez conseguido un registro satisfactorio, y habiendo alcanzado nuevamente la pluma la línea base, se interrumpe el funcionamiento del registrador y se retira el papel con el registro para la identificación de los picos y/o cálculos cuantitativos.
2.2.Identificación de los picos. Se seguirán los criterios establecidos en el apartado de observaciones (punto 2).
2.3.Determinaciones cuantitativas: La determinación cuantitativa se basa en el principio de que los pesos de cada uno de los componentes separados en la mezcla son proporcionales a las áreas comprendidas dentro de los triángulos dibujados debajo de cada pico. El área de cada triángulo se obtiene trazando rectas tangentes a las líneas dibujadas en el registro, prolongándolas hasta su intersección con la línea base y multiplicando la altura del triángulo por la mitad de la base. En el caso de haber trabajado con atenuaciones diferentes para cada pico, se referirán todas las medidas a una misma sensibilidad del registrador, multiplicando la altura por el factor de atenuación correspondiente en cada caso, y el valor de la altura así corregida por la mitad de la base.
3.Determinación del contenido de los ácidos butírico y caproico en la materia grasa: Esta determinación se realiza por el método del patrón interno, siendo el patrón elegido el metilo pentanoato. 
3.1.Preparación de la mezcla de calibración: Con una exactitud de ±0,1 mg y en un matraz aforado de 50 ml, pesar unos 100 mg de cada uno de los siguientes patrones: metilo butanoato, metilo pentanoato y metilo caproato. Se disuelve la mezcla de n-heptano y se diluye completando hasta el volumen de enrase. Inyectar la cantidad necesaria de la solución anterior, normalmente 0,2-0,4 µl, para que, trabajando a la sensibilidad media del aparato, se consiga situar los máximos de los picos en una posición del 70-80% del recorrido total de la pluma del registrador. Los tres picos deberán registrarse a la misma sensibilidad. Si fuese necesario, se diluirá la solución anterior con n-heptano en la relación necesaria para poder ajustarse a las prescripciones fijadas. Efectuar, cuando menos, tres determinaciones consecutivas, que no deben discrepar entre sí mas del 1%.
4.Análisis cuantitativo de la totalidad de los componentes de la fracción de ácidos grasos, comprendiendo el C₄ al C₂₀ y el C_18:3
4.1.Preparación de la mezcla de calibración: Determinar previamente el factor de corrección para cada ácido componente de la mezcla, referido a uno cualquiera de ellos que se toma como patrón, eligiéndose normalmente para este fin el ácido palmítico y, debiendo tener la mezcla de calibración una composición análoga a la de la mezcla problema. Para ello, si no se conoce previamente el orden de composición del problema, se realizará una determinación cromatográfica de orientación, en el registro se hará la cuantificación de los componentes, con el mismo factor de respuesta para todos ellos, efectuando un reparto proporcional entre las áreas medidas. En un matraz aforado de 50 ml, pesar, con una exactitud de ±0,1 mg, las cantidades de los ésteres metílicos patrones que se indican a continuación proporcionales a las cifras de composición encontradas en el análisis de orientación anteriormente aludido, o previstas con anterioridad para la muestra. Los patrones que deben pasarse son los siguientes: metilo butanoato, metilo hexanoato, metilo octanoato, metilo decanoato, metilo dodecanoato, metilo tetradecanoato, metilo hexadecanoato, metilo octadecanoato, metilo oleato, metilo linoleato y metilo eicosanato. Se disuelve la mezcla de n-heptano agregando la cantidad adecuada de disolvente en relación al peso total de ésteres metílicos que se hayan pesado; para unos 50 ml de n-heptano (PA). A continuación inyectar 0,2-0,4µl para que, trabajando a la sensibilidad media del aparato, se consiga situar el máximo del pico correspondiente al componente mayoritario, en una posición del 70-80% del recorrido total de la pluma del registrador. Todos los picos deben registrarse a la misma sensibilidad, lo cual suele ser perfectamente factible en la grasa de leche; en aquellos casos en que la relación entre el pico mayoritario y el pico minoritario no permita registrar este último con las dimensiones adecuadas para efectuar una cuantificación correcta de su área, se podrá efectuar el cambio necesario en la atenuación del registro, procurando que éste no sobrepase la relación de 4:1. Si fuese necesario, se diluirá la solución con n-heptano en la relación necesaria para poder ajustarse a las prescripciones fijadas. Efectuar, cuando menos, tres determinaciones consecutivas, que no deben discrepar entre sí más del 1%.

Expresión de los resultados.
Los distintos resultados se obtienen mediante las siguientes fórmulas:
1-Cálculo de los factores de corrección para los ácidos butírico y caproico: Se determinan las áreas de los tres picos, siguiendo las normas que se contienen en el apartado ya descrito en la técnica de cromatografía de gases de esteroles, y se calculan los dos factores correspondientes al C₄ y C₆, del modo siguiente:

f_x = x. Ap/ P. A_x

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
f _x = factor de corrección del componente ácido x.
x = cantidad pesada del ácido x.
Ap = área medida en el registro para el patrón del pentanoato. 
A_x = área medida en el registro para el ácido x.
P = peso del patrón pentanoato.

2-Cálculo del contenido de ácidos: Los contenidos de ácido butírico y ácido caproico en la muestra de grasa de la mantequilla se calculan mediante la siguiente fórmula:

Contenido de ácidos (en %) = 100. f _x A_x P / Ap  M

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
f _x = factor de corrección determinado para cada ácido, según lo indicado en el apartado anterior.
A_x = área medida en el registro para el ácido x.
P = peso del patrón interno (pentanoato).
Ap = área medida en el registro para el patrón interno.
M = peso de la muestra de grasa.

3-Cálculo de los factores de corrección: Una vez determinadas las áreas de todos los picos, siguiendo las normas descritas en el procedimiento analítico, se calcula el factor de corrección de cada ácido, referido al ácido palmítico, como unidad de referencia, empleando la fórmula incluida en este apartado (punto 1), para lo que se sustituye el área Ap y el peso P del compuesto patrón por los valores correspondientes al metilo palmitato. 

4-Cálculo de la composición de la fracción de ácidos grasos: Se calcularán las áreas corregidas de cada uno de los componentes de la fracción multiplicando el área medida en el registro por el factor de corrección determinado según lo indicado en el apartado anterior (punto 3). El contenido de cada componente se calcula mediante la siguiente fórmula:

Fracción de ácidos grasos (en %) = X = 100. f _x A_x /  Σ(f_x . A_x)

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:
f _x = factor de corrección del componente x.
A_x = área medida en el registro para el componente x.
Σ(f_x . A_x) = suma de todas las áreas corregidas correspondientes a los componentes de la fracción.

9.6. Observaciones: 
1.La puesta a punto de la columna se determina obteniendo la resolución de dos productos críticos como son el metilo oleato y el estearato. La resolución viene determinada por la siguiente expresión:

Resolución = 2 D/ O + E

siendo:
D = distancia entre los dos máximos de los picos del oleato y el estearato.
O = ancho de la base del pico correspondiente al oleato.
E = ancho de la base del pico correspondiente al estearato.

Estos valores se determinan sobre el cromatograma obtenido con una muestra conteniendo cantidades aproximadamente iguales de metilo estearato y oleato, inyectando una cantidad tal que la altura de estos picos alcance al 25-50% del ancho del papel de registro. Si la resolución calculada es igual o mayor que 1,0 la columna y el instrumento se encuentran en condiciones satisfactorias. Todas las columnas en el transcurso de su utilización sufren una pérdida gradual en la resolución de los picos; cuando el valor llegue a ser inferior a 1,0 deberá instalarse una nueva columna.
2.Para la identificación de los picos se pueden seguir los dos criterios siguientes:
2.1.Criterio basado en los tiempos de retención: Refiriéndose exclusivamente a los ácidos que entran normalmente en la composición de las grasas naturales, sus ésteres aparecen en el cromatograma en orden creciente de sus átomos de carbono y a su insaturación. Esto significa que el palmítico (C₁₆) aparece delante del esteárico (C₁₈), y los ésteres en C₁₈ aparecen en el orden estearato, oleato, linoleato y linolenato. El éster del ácido aráquico (C_20:0), usualmente, aparecen antes del linoléico (C₁₈:₃), pero en algunos casos puede ocurrir lo contrario, dependiendo del tipo de columna y de las condiciones de su utilización, o incluso superponerse uno al otro. Operando en condiciones constantes, los tiempos de retención son reproducibles en cada especie química, siendo el criterio más frecuente empleado para su identificación. El tiempo de retención viene dado por la distancia, medida en el cromatograma, entre el máximo del pico del aire y la posición del máximo de la banda. Trabajando con detector de llama de hidrógeno, la salida del aire no se detecta, pudiéndose escoger, en este caso, el momento en que se inicia la salida del disolvente, acusada por una fuerte deflexión de la pluma del registrador.
2.2.Criterio basado en los tiempos de retención relativos: Los tiempos de retención relativos son más reproducibles. Las retenciones relativas vienen determinadas por el cociente de dividir el tiempo de retención de cada pico por el tiempo registrado para el pico del metilo palmitato, o bien por otro éster que se tome como comparación, determinados todos ellos según el criterio expuesto en el párrafo anterior.

Referencias.

-Métodos de análisis. Boletín Oficial del Estado (21/7/1977 y 22/7/1977).
-Instituto de Racionalización y Normalización del Trabajo. Una Norma Española 55.118.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: ÍNDICE DE KIRSCHNER EN MANTEQUILLA-1

Continuando con las técnicas de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación del índice de Kirschner en la mantequilla.

Reactivos necesarios.
-Ácido sulfúrico (PA).
-Agua destilada (PA).
-Bario hidróxido 8-hidrato (PA).
-Fenolftaleína en solución al 1% (PE).
-Plata sulfato (PRS).
-Sodio hidróxido 1 N (SV).

Procedimiento analítico.
1-Neutralizar, con precisión, 100 ml del destilado Reichert-Meissl con solución de bario hidróxido 0,1 N, preparada a partir de bario hidróxido 8-hidrato (PA), hasta obtener un débil color rosado empleando 0,5 ml del indicador. Realizar la titulación en un matraz cerrado para evitar la absorción de CO₂.
2-Añadir 0,3 g de plata sulfato en forma de polvo fino. Dejar reposar la mezcla una hora, agitando con frecuencia y filtrándola después.
3-Recoger 100 ml del filtrado, colocarlo en un frasco de destilación de 300 ml, añadir 35 ml de agua destilada (PA), y 10 ml de ácido sulfúrico diluido. Añadir un trozo de alambre de aluminio o varios trozos de piedra pómez para evitar que el líquido rebose. Se une al destilador y se comienza la destilación a la velocidad de 110 ml en unos 20 minutos.
4-Después de recoger los 110 ml del destilado, filtrar este volumen total, procediendo a la titulación de 100 ml con sodio hidróxido 1N, con 0,5 ml de fenolftaleína en solución al 1%, hasta lograr un tono rosado que persista durante 2-3 minutos.
5-Preparar y realizar una prueba en blanco semejante al procedimiento anterior.

Expresión de los resultados.
El índice o valor de Kirschner de la mantequilla se obtiene por la fórmula siguiente:

Índice de Kirschner = A x 121 x (100 + B)/ 10.000

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:

A = Titulación de la muestra – titulación en blanco.
B = volumen, en ml, de bario hidróxido 0,1 N, requeridos para neutralizar los 100 ml originales del destilado de Reichert-Meissl.

Referencias.

-Métodos de análisis. Boletín Oficial del Estado (21/7/1977 y 22/7/1977).
-Norma Internacional AOCS 5-40.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: FOSFATASA EN MANTEQUILLA-1

Continuando con las técnicas de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación de la fosfatasa residual en la mantequilla.

Principios y fundamentos metodológicos. 
El ensayo se basa en la acción del enzima fosfatasa sobre el sustrato sodio fenilfosfato dibásico, con liberación de fenol y fosfato. La cantidad de fenol liberada se determina por adición de un reactivo que produce coloración azul en presencia de fenol. Si las cantidades detectadas son superiores a dos equivalentes de fenol en 0,5 gramos de mantequilla, la pasterización ha sido insuficiente.

Material y aparatos utilizados.
-Cuchillo o espátula de acero inoxidable.
-Baño de agua a 37-38 ºC.
-Termómetro.
-Pipetas de 1 ml.
-Embudo de 5 cm de diámetro.
-Papel Whatman número 42 (o número 2).
-Tubos graduados de 5 y 10 ml.
-Fotómetro con filtro de transmitancia máxima a 610 nm.
-Centrífuga.
-Pera de goma para pipetar.

Reactivos necesarios.
-Ácido bórico (PA).
-Agua destilada (PA).
-Ácido n-butílico (PA).
-Alcohol etílico absoluto (PA).
-Bario hidróxido 8-hidrato (PA).
-Cobre II sulfato 5-hidrato.
-2,6-dibromoquinona clorimida (BQC).
-Fenol cristalizado (PA).
-Sodio meta-borato. 
-Sodio cloruro (PA).
-Sodio fenilfosfato dibásico 2-hidrato (RE).
-Zinc sulfato 1-hidrato (PA).

La preparación de la solución tampón bario hidróxido se realiza disolviendo 18 g de bario hidróxido 8-hidrato (PA) y 8 g de ácido bórico (PA) en agua destilada (PA), completando con ésta hasta un volumen de 1 litro.
La solución tampón de desarrollo de color a un pH de 9,8 ± 0,15 a 25ºC, se prepara disolviendo 6 g de sodio meta-borato (NaBO₂), y 20 g de sodio cloruro (PA) en agua destilada (PA), diluyendo con ésta hasta completar un volumen de 1 litro con agua destilada.
Para el tampón de dilución de color, se disuelven 100 ml de tampón de desarrollo de color hasta completar 1 litro con agua destilada (PA).
En el caso del sustrato tampón se diluyen 0,10 g de sodio fenilfosfato dibásico 2-hidrato cristalino libre de fenol en 100 ml de tampón bario-hidróxido borato; teniendo en cuenta que los cristales de sodio fenilfosfato dibásico 2-hidrato deben guardarse en el congelador o en un desecador: Si el sodio fenilfosfato dibásico 2-hidrato no está libre de fenol, deberá purificarse disolviendo 0,5 g con 4,5 ml de agua destilada (PA), añadiendo 0,5 ml de tampón bario-hidróxido borato y dos gotas del reactivo BQC y dejar reposar 30 minutos. Extraer el color con 2,5 ml de alcohol n-butílico (PA) y se deja reposar hasta que el alcohol se separe. Retirar el alcohol con un cuentagotas y desecharlo. Diluir 1,0 ml de la solución acuosa a 100 ml de tampón bario-hidróxido borato. Calentar la solución a 85 ºC durante 2 minutos, tapar inmediatamente y conservar en el refrigerador. La solución puede permanecer estable un año si las porciones son recogidas con mínima exposición a la atmósfera.
La solución de 2,6-dibromoquinona clorimida (BQC) o reactivo de Gibbs se prepara disolviendo 40 mg de BQC en polvo en 100 ml de alcohol etílico absoluto (PA) o alcohol metílico (PA), y se guarda en un frasco cuentagotas oscuro. Si se guarda en el congelador este reactivo permanece estable por lo menos un mes, evitando usarse después de que empiece a ponerse pardo. Se recomienda guardar el BQC en polvo en el congelador o desecador, para evitar posibles exposiciones si se almacena en botellas en las estanterías del laboratorio o en el almacén de reactivos. Antes de su utilización, hay que comprobar los nuevos lotes de BQC, preparando una curva patrón con fenol y su posterior comparación de la curva obtenida con la de BQC que se sabe es satisfactoria. Repetir la prueba al menos semestralmente.
La solución de cobre II sulfato para los patrones se prepara disolviendo 0,05 g de cobre II sulfato 5-hidrato (PA) en agua destilada (PA), diluyendo a 100 ml.
La preparación del alcohol n-butílico (PA) se realiza utilizando alcohol n-butílico normal, con un punto de ebullición de 116-118ºC. El ajuste del pH se hace mezclando 1 litro con 50 ml de tampón de desarrollo de color, y se guarda en un recipiente con tapón de vidrio.
La solución patrón fenol se prepara siguiendo el siguiente protocolo:
1.Solución madre: Pesar exactamente 1.000 g de fenol cristalizado (PA) puro, que se introduce en un matraz aforado de 1 litro, se diluye con agua destilada (PA) hasta completar un volumen de 1 litro, y se mezcla, teniendo en cuenta que 1 ml = 1 mg de fenol. Esta solución es estable varios meses en refrigerador.
2.Patrones de trabajo: Diluir 10,0 ml de la solución madre con agua destilada (PA) hasta completar 1 litro y mezclar, teniendo en cuenta que 1 ml = 10/μg, 0,00001 g o 10 unidades de fenol. Usar esta solución patrón para preparar soluciones patrón más diluidas: por ejemplo, diluir 5, 10, 30 y 50 ml con agua destilada (PA) hasta 100 ml para preparar soluciones patrón, que contenga 0,5; 1,0; 3,0 y 5,0 μg o unidades de fenol/ml, respectivamente. Guardar estas soluciones patrón en refrigerador durante un tiempo no superior a una semana. Análogamente preparar, a partir de la solución madre (del punto anterior), varias soluciones patrón que contengan 20, 30 y 40 unidades/ml. Medir las cantidades adecuadas de las soluciones patrón de trabajo en una serie de tubos, preferiblemente graduados a 5,0 y 10,0 ml, con objeto de conseguir un intervalo adecuado de patrones, según se necesite, que contengan las siguientes cantidades: 0 (control o prueba en blanco); 0,5; 1,0; 3,0; 5,0; 10,0; 20,0; 30,0 y 40,0 unidades. Para aumentar el brillo de las soluciones azules y mejorar la estabilidad de los patrones, añadir a cada tubo 1,0 ml de solución de cobre II sulfato; después se añade 5,0 ml del tampón de solución de color, diluyendo con agua destilada (PA) hasta 10,0 ml; seguidamente se añaden 4 gotas (0,08 ml) de la solución BQC, se mezcla y se deja desarrollar el color azul durante 30 minutos a temperatura ambiente. Leer las intensidades de color en el fotómetro con filtro de 610 nm, restando el valor de la prueba en blanco del color de cada patrón de fenol y preparar la curva patrón, que deberá ser una línea recta. Si los patrones han de usarse para comparación visual, hay que guardarlos en el refrigerador; semanalmente se deberá preparar una serie nueva.

Procedimiento analítico.
Se realiza la toma de la muestra del interior de la mantequilla (debajo de la superficie), usando un cuchillo y una espátula limpios y se procede a pesar por duplicado, 1,0 g, que se coloca sobre un trozo de papel encerado de 1 pulgada cuadrada, aproximadamente, y seguidamente se introduce en un tubo. Análogamente, pesar otra muestra y colocarla en un tubo como control o patrón. Calentar el patrón aproximadamente durante 1 minuto a 85-90 ºC en un vaso de agua hirviendo, y se deja enfriar a temperatura ambiente. A partir de este momento, se procede de la misma forma con el patrón y el problema. Añadir 10,0 ml de sustrato patrón, tapar el tubo y mezclar. Inmediatamente después de añadir el sustrato, incubar durante 1 hora en un baño de agua a 37-38 ºC, mezclando o agitando el contenido de vez en cuando. Calentar en el vaso de agua hirviendo aproximadamente 1 minuto hasta alcanzar una temperatura de 85-90 ºC para lo que se utiliza un termómetro dispuesto en otro tubo del mismo tamaño y forma, y que contenga el mismo volumen de líquido,: se deja enfriar a temperatura ambiente en un recipiente de agua fría. Pipetear en 1 ml de solución de zinc sulfato de 6,0 g/100 ml y mezclar por completo hasta alcanzar un valor de pH en la mezcla de 9,0-9,1. Filtrar con un embudo de 5 cm y papel Whatman número 42 (o número 2), y recoger 5,0 ml de filtrado en el tubo (preferentemente graduado a 5,0 y 10,0 ml). Añadir 5,0 ml de tampón de desarrollo de color; el pH de la mezcla ha de ser 9,3-9,4. Seguidamente se añaden 4 gotas de la solución BQC, y se deja reposar 30 minutos a temperatura ambiente para favorecer el desarrollo de color; para determinar la pasterización, añadir solamente 2 gotas de solución BQC.
Determinar la intensidad del colo azul por uno de los siguientes métodos:
a) Con fotómetro: Leer las intensidades de color de las soluciones (en blanco y problema), utilizando un filtro con una transmitancia máxima de aproximadamente 610 nm, y restar la lectura de la prueba en blanco de la del problema, expresando el resultado en equivalentes de fenol mediante referencias a la curva patrón obtenida con las correspondientes soluciones (patrones de trabajo). Generalmente es innecesaria la extracción con alcohol n-butílico cuando se utiliza el fotómetro; en el caso de que se haga la extracción con alcohol n-butílico como en el siguiente método (punto b), hay que centrifugar la muestra 5 minutos para romper la emulsión y separar el agua suspendida en la capa de alcohol, para lo cual puede utilizarse una centrífuga Babcock con la incorporación de adaptadores especiales para tubos en la forma siguiente: 1) Cortar una sección de ¼'' de grueso de un tapón de goma de diámetro adecuado, que ajuste en el fondo del vaso de centrifugación; 2) Pegar dos tapones de corcho de diámetro adecuado, perforar en el centro un orificio de dimensiones adecuadas para alojar un tubo ajustadamente e introducir la sección doble de corcho en el vaso. 3) Después de centrifugar, quitar prácticamente todo el alcohol n-butílico con una pipeta provista de una pera de goma en el extremo superior. 4) Filtrar dentro de la cubeta del fotómetro, y leer con filtro cuyo máximo de transmitancia es aproximadamente de 650 nm.
b) Con patrones visuales: Con muestras que dan más de 5 unidades, comparar colores en tubos con los de los patrones de fenol en solución acuosa (patrones de trabajo). Para cuantificar los resultados en los casos dudosos, por ejemplo, en los problemas que producen 0,5-5 unidades de color, hay que extraer con alcohol n-butílico preparado anteriormente, añadiendo para ello 5,0 ml de alcohol e invertir el tubo lentamente varias veces; centrifugar, en caso de que sea necesario incrementar la transparencia de la capa de alcohol, como en el paso anterior (punto a), y comparar el color azul con los colores de los patrones de fenol, análogamente tratados. En los problemas que se consideren muy positivos durante el desarrollo de color (por ejemplo, 20 unidades), en los que las 4 gotas de solución BQC pueden ser insuficientes para combinar con todo el fenol, se debe pipetear una proporción adecuada de contenidos dentro de otro tubo, diluir hasta 10,0 ml con tampón de dilución de color, y añadir 2 gotas adicionales de solución BQC; diluyendo y tratando con cada problema de la misma forma, la prueba en blanco. En el caso de que la prueba sobre la muestra diluida sea todavía muy fuertemente positiva, hay que diluir de nuevo del mismo modo hasta que el color final esté dentro del intervalo de los patrones visuales o de la curva patrón del fotómetro. Después de la última adición de la solución de BQC hay que dejar reposar 30 minutos para el desarrollo de color, antes de hacer la lectura final. Para corregir las lecturas por dilución, hay que multiplicar por 2 para la dilución 5 + 5, por 10 para dilución 1 + 9, y por 50 dilución 1 + 9 seguida de dilución 2 + 8, etc.

Expresión de los resultados.
Cuando se utilice 1,0 g de mantequilla y se añadan 11,0 ml de líquido, hay que multiplicar el valor de la lectura por 1,1 para convertir el resultado en equivalentes de fenol/ 0,5 g de mantequilla. Los valores superiores a 2 equivalentes/0,5 g de mantequilla indican que el tratamiento de pasterización ha sido insuficiente. 

Referencias.

-Métodos de análisis. Boletín Oficial del Estado (21/7/1977 y 22/7/1977).
-Official Methods of Analysis, A.O.A.C 11^a Ed. (1970).
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: SAL EN MANTEQUILLA-1

Continuando con las técnicas de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación del contenido de sal en la mantequilla.

Principios y fundamentos metodológicos. 
Se entiende por contenido de sal de la mantequilla, expresado en cloruro sódico, el porcentaje en masa de la sal determinado por el procedimiento que se describe a continuación. Es necesario fundir previamente la mantequilla a analizar añadiendo agua hirviendo, y después se realiza la valoración de los cloruros de las mezclas con una solución de nitrato de plata, empleando cromato potásico como indicador, según el procedimiento de Mohr. Finalmente, se calcula el contenido de sal de la mantequilla.

Material y aparatos utilizados.
-Balanza analítica.
-Matraces erlenmeyer de 250 ml de capacidad.
-Bureta graduada, contrastada en divisiones de 0,1 mililitros.

Reactivos necesarios.
-Agua destilada (PA).
-Plata nitrato 0,1 N (SV).
-Potasio cromato en solución al 5% (p/v, RE).

Procedimiento analítico.
1-Preparación de la muestra de mantequilla: En un recipiente cerrado se procede a ablandar la muestra de mantequilla, calentándola en baño de agua a la temperatura más baja posible, con objeto de no romper la emulsión. Frecuentemente, se realiza esta operación a una temperatura entre 23 y 28 ºC, que en ningún caso podrá exceder de 39 ºC. Con objeto de conseguir un mezclado homogéneo hay que agitar varias veces el recipiente, que contiene la muestra a analizar, favoreciendo así el ablandamiento de la misma. Seguidamente hay que sacar el recipiente del baño de agua y agitarlo vigorosamente a intervalos frecuentes hasta que la muestra se haya enfriado adquiriendo una consistencia espesa y cremosa. Esta operación puede realizarse con un agitador mecánico.
2-Ensayo en blanco: Hay que realizar una 'determinación en blanco', para lo que se utilizan los mismos reactivos, en idénticas cantidades, siguiendo el procedimiento descrito a continuación. Se pesan 5 g de la muestra, con una precisión de 10 mg, y se introduce en un matraz erlenmeyer. A continuación, se añaden cuidadosamente 100 ml de agua destilada (PA) hirviendo, se deja reposar durante 5-10 minutos, agitando por rotación de forma frecuente, para su enfriamiento hasta una temperatura de 50-55 ºC (temperatura de valoración). Seguidamente, se añaden 2 ml de solución de potasio cromato, y se mezcla agitando por rotación; la valoración se realiza con la solución de plata nitrato 0,1N (SV), agitando continuamente hasta que el cambio de color a anaranjado pardo persista durante 30 segundos.

Expresión de los resultados.
El contenido de sal de la mantequilla, expresado en porcentaje por masa de cloruro sódico, se obtiene por la fórmula siguiente:

Contenido de sal (en %) = (v1 - v0) x t x 5,85/ a

teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:

t = normalidad de la solución de plata nitrato.
v1 = volumen, en ml, de solución de plata nitrato, utilizados en la valoración de la muestra.
v0 = volumen, en ml, de solución de plata nitrato en el ensayo en blanco.
a = masa, en gramos, de la muestra de mantequilla utilizada.

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas no deberá ser mayor de 0,02 gramos de cloruro sódico por 100 gramos de producto analizado.

Referencias.

-Métodos de análisis. Boletín Oficial del Estado (21/7/1977 y 22/7/1977).
-Norma FIL-IDF 12A: 1969.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: ÍNDICE DE REFRACCIÓN DE GRASA EN MANTEQUILLA-1

Continuando con las técnicas de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación del índice de refracción de la materia grasa en la mantequilla.

Principios y fundamentos metodológicos. 

El índice de refracción de la materia grasa en la mantequilla es la razón entre la velocidad de una luz de longitud de onda determinada (luz de sodio) en el aire y la velocidad de esta misma luz en la materia grasa de la mantequilla a 40 ºC. Este índice de la materia grasa se determina mediante un refractómetro apropiado, con la muestra de mantequilla fundida previamente.

Material y aparatos utilizados.
-Refractómetro provisto de una escala graduada en índices de refracción, que permita efectuar lecturas hasta la tercera cifra decimal y cuyos prismas pueden calentarse mediante un líquido circulante, regulándose la temperatura termostáticamente con una aproximación de ±0,1 ºC.
-Luz de sodio: Se puede utilizar también la luz blanca si el refractómetro tiene un dispositivo de compensación cromática.

Procedimiento analítico.
Para separar la materia grasa, hay que fundir la muestra de mantequilla, dejándola reposar luego durante 2 o 3 horas a una temperatura de 50-60 ºC; seguidamente se procede a su decantación y filtrado empleando un papel de filtro seco. En el caso de que el primer filtrado no sea claro, se debe filtrar nuevamente. A continuación, se utiliza la materia grasa fundida, clarificada, bien mezclada sin agua. Es necesario preparar y regular el refractómetro, según el modo de empleo del aparato, ajustando la temperatura del líquido circulante a 40 ± 0,1 ºC. El procedimiento consiste en colocar algunas gotas de materia grasa, preparada en la forma anteriormente descrita, entre los prismas del refractómetro, llenado por completo el espacio comprendido entre ellos, y se deja transcurrir algunos minutos para que la materia grasa alcance la temperatura de los prismas. Hay que efectuar la lectura con cuatro cifras decimales, debiendo corregirse el índice de refracción obtenido añadiendo el valor de 0,000045 unidad de índice de acidez si este último (determinado el método ya descrito) es igual o superior a dos, y finalmente hay que redondear la cuarta cifra decimal.

Expresión de los resultados.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas no debe ser mayor de 0,0002 de la unidad de índice de refracción.

Referencias.

-Métodos de análisis. Boletín Oficial del Estado (21/7/1977 y 22/7/1977).
-Norma FAO B-5: 1967.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: ÍNDICE ACIDEZ DE GRASA EN MANTEQUILLA-1

Continuando con las técnicas de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación del índice de acidez de la materia grasa en la mantequilla.

Principios y fundamentos metodológicos. 

El índice de acidez de la materia grasa en la mantequilla es el número de miligramos de potasio hidróxido que se necesita para neutralizar 1 gramo de materia grasa de la muestra a analizar. La materia grasa, una vez separarla por fusión de la mantequilla, se disuelve en una mezcla de alcohol-éter, procediendo a su titulación con una solución alcalina valorada previamente.

Material y aparatos utilizados.
-Balanza analítica.
-Matraces erlenmeyer de 300 ml.
-Bureta graduada contrastada, con divisiones de 0,1 ml.

Reactivos necesarios.
-Alcohol etílico absoluto (PA).
-Alcohol etílico al 96% (v/v, PA).
-Alcohol metílico (PA).
-Éter etílico (PA).
-Fenolftaleína (PA).
-Potasio hidróxido 0,1 N etanólica (SV).
Se mezclan volúmenes iguales de alcohol etílico de 96% (v/v, PA), y de éter etílico (PA).
La solución neutra de fenolftaleína (PA) se prepara al 1% (m/v) en alcohol etílico de 96% (v/v, PA) desnaturalizado con alcohol metílico (PA). En este caso, para obtener el alcohol desnaturalizado se emplean 100 partes de alcohol absoluto y 5 partes de alcohol metílico.
Todos los reactivos que se utilicen deben ser de calidad pura para análisis.

Procedimiento analítico.
Se funde la muestra de mantequilla para separar la materia grasa, y se deja reposar durante 2-3 horas a una temperatura de 50-60 ºC; seguidamente se deja decantar y se filtra con un papel de filtro seco. En el caso de que el primer filtrado no sea claro, se filtra nuevamente. Para el análisis se debe utilizar la materia grasa fundida, clarificada, y bien mezclada. A continuación, en un matraz erlenmeyer se pesan 5-10 g de materia grasa, con una precisión de 1 mg; se añaden 50-100 ml de la mezcla de alcohol etílico al 96% (v/v, PA) y éter etílico (PA), disolviendo la materia grasa en esta mezcla; después se adiciona 0,1 ml de la solución de fenolftaleína (PA), valorando con la solución alcalina hasta que aparezca una coloración rosa pálido que persista al menos 10 segundos.

Expresión de los resultados.
El índice de acidez de la materia grasa de la muestra de mantequilla, se obtiene por la fórmula siguiente:

Índice de acidez = V x t x 56,1/ A
teniendo en cuenta que el significado de los factores de la fórmula son:

V = volumen, en mililitros, de la solución alcalina empleada.
t = normalidad de la solución alcalina.
A = masa, en gramos, de la porción de muestra analizada.

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas no debe ser mayor de 0,1 mg de potasio hidróxido por 1 g de materia grasa.

Referencias.

-Métodos de análisis. Boletín Oficial del Estado (21/7/1977 y 22/7/1977).
-Norma FIL-IDF G A: 1969.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: PREPARACIÓN DE MANTEQUILLA-1

Continuando con las técnicas de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la preparación de la muestra de la mantequilla.

Principios y fundamentos metodológicos. 

Se exponen a continuación los métodos publicados en el Boletín Oficial del Estado (BOE, de 5/01/1975, Anejo único, apartado 1).

La finalidad de esta operación es preparar la muestra de una unidad de mantequilla, envasada en recipiente o paquete, a partir de una subunidad homogénea lo más representativa posible del producto a analizar.

Material y aparatos utilizados.
Habitualmente se utilizan los siguientes materiales:
-Sondas de acero inoxidable, con una longitud suficiente para alcanzar diagonalmente la base del recipiente, y diámetro igual o superior a 30 mm.
-Espátulas o cuchillos de acero inoxidable, para retirar parte de la muestra tomada con la sonda.
-Recipientes cilíndricos de boca ancha, de vidrio o de acero inoxidable, esterilizables, de capacidad adecuada al tamaño de la muestra a tomar y provistos de cierre hermético.
Todos los materiales utilizados deberán estar secos y limpios, y no deberán comunicar otros olores ni sabores extraños. Si la muestra se destina a análisis microbiológico, el material se esterilizará por tratamiento con alcohol seguido de flameado, o por inmersión en agua a + 100 ºC, al menos durante treinta segundos, y se enfriarán a temperatura ambiente antes de su uso.

Procedimiento analítico.
1-Toma de muestras: Se tomará un número suficiente de muestras parciales para que el peso de la muestra final sea al menos de 200 gramos, siguiendo lo establecido por la legislación vigente. Según la forma y peso del envase de la mantequilla, se aplicará una de las técnicas siguientes:
a) Mantequilla en bloques o recipientes autorizados de peso unitario superior a un kilogramo: Se harán dos 'sondajes' en la mantequilla a analizar. Uno de éstos, se realiza introduciendo una sonda en diagonal a través del bloque de mantequilla, a partir de una esquina de la extremidad abierta del recipiente. El segundo sondaje se obtendrá introduciendo la sonda verticalmente desde un punto de la superficie del producto elegido arbitrariamente, hasta alcanzar la base del recipiente. La muestra final comprenderá porciones tomadas de diferentes puntos de los dos sondajes, obteniendo un peso total mínimo de 200 g. Es recomendable que los recipientes para las muestras no se llenen menos de dos tercios ni más de nueve décimos de la capacidad de los mismos. Inmediatamente después de cerrados los recipientes que contienen la mantequilla, serán envueltos en papel y almacenados en un sitio oscuro, evitando el contacto directo de la muestra con el papel ni con ninguna otra superficie absorbente de agua o grasa.
b) Mantequilla en recipientes autorizados de peso unitario comprendido entre 0,25-1 kg: Dividir las unidades en cuatro partes aproximadamente iguales, eligiendo como muestra final dos partes opuestas o las fracciones correspondientes a las mismas, hasta conseguir un peso mínimo de 200 g. Los recipientes para las muestras no se llenarán menos de dos tercios ni más de nueve décimos de su capacidad. Inmediatamente después de cerrados serán envueltos en papel y almacenados en sitio oscuro.
c) Mantequilla en recipientes autorizados de peso unitario inferior a 0,25 kg: Se tomará como muestra final el número de unidades enteras necesarias para conseguir un peso mínimo de la misma de 200 g. El número de unidades enteras se tomarán con su envase y, en este caso, aparte de los recipientes autorizados, se podrán emplear bolsas de plástico protegidas por una bolsa de papel. Estas bolsas no se llenarán menos de dos tercios ni más de nueve décimos de su capacidad útil.
2-Conservación de las muestras: No se adicionarán conservadores de ningún tipo a las distintas muestras de mantequilla, siendo necesario su almacenamiento en cámara fría. Las muestras de mantequilla, destinadas a análisis microbiológico o examen organoléptico, se conservarán a una temperatura entre 0 y 5 ºC.
3-Transporte de muestras: Después de la toma, las muestras serán transportadas al laboratorio lo más rápidamente posible, a una temperatura inferior a 10 ºC; en el caso del análisis microbiológico dicha temperatura no debe sobrepasar de 5 ºC.
4-Preparación de la muestra para las distintas determinaciones: En los productos presentados en los formatos descritos en los apartados a) y b), se colocará el recipiente con la muestra al baño María, sin sobrepasar la temperatura de 39 ºC, hasta obtener una consistencia óptima y una fluidez homogénea. La emulsión obtenida debe quedar intacta, pero fluida, notándose claramente el nivel alcanzado; seguidamente, se saca la muestra del baño María, dejándose reposar hasta enfriamiento.

Referencias.
-Métodos de análisis. Boletín Oficial del Estado (5/1/1975, Anejo único, apartado 1).
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)