En un trabajo de investigación se ha puesto a punto el sexaje de embriones en ovino mediante la técnica de PCR, orientado a la producción de machos mejorantes del esquema de selección UPRA-OVIARAGON (Zaragoza, España).
La técnica MOET consiste en superovular las hembras de alto valor genético, inseminarlas con semen de machos adecuados y obtener los embriones, que son transferidos a otras hembras receptoras. Esta tecnología permite explotar mejor el potencial genético de los animales y acelerar la velocidad de selección. Por dicha razón, dentro del esquema de mejora por prolificidad puesto en marcha por la UPRA-Carnes Oviaragón desde 1994 se contempla que la producción de machos que van a ser testados se realice a través de un programa MOET. Desde los años 80 se van realizando numerosos estudios para poner a punto la técnica MOET en ovino. Sin embargo, el número de descendientes obtenidos en cada superovulación sigue siendo relativamente bajo. Evidentemente, la técnica sería más rentable y efectiva si se pudiese conocer el sexo de los embriones obtenidos previamente a su transferencia.
La extracción de ADN se ha realizado a partir de diferente número de células procedentes de biopsias de mórulas y blastocistos, mediante el kit de extracción “BLOODCLEAN DNA Purification kit” (Biotools). El sexaje de embriones se realizó mediante amplificación específica por PCR de un fragmento de ADN del cromosoma Y (SRY gene; GenBank Acc. Z30265; Griffiths y Tiwari, 1993). La amplificación se realizó en un volumen final de 25 ml conteniendo 5 pmol de cada cebador, 200 nM dNTPs, 2,2 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 0,1% Triton X-100 y 0.8 U Taq polymerasa (Biotools). Se realizaron 35 ciclos de amplificación con un paso de desnaturalización a 94 ºC durante 30 s, de hibridación a 55 ºC durante 30 s, y de extensión a 72 ºC durante 40 s. Previo a los ensayos con embriones se realizaronpruebas de sensibilidad mediante dilución a partir de ADN genómico extraído de células sanguíneas. Las diluciones utilizadas contenían 20 ng, 2 ng, y 200, 20, 2, 0,2 pg. Igualmente, con el fin de incrementar la seguridad y sensibilidad de la técnica, se ha llevado a cabo la puesta a punto de una PCR doble en dos etapas. Esta PCR consiste en una doble amplificación de dos fragmentos de ADN mediante PCR, uno del gen CGN (GenBank Acc.AY785290), gen estructural que se amplifica tanto en machos como en hembras, y por otra parte el fragmento específico de ADN del cromosoma Y (SRY gene). La amplificación se realizó en un volumen final de 20 ml conteniendo 5 pmol de cada cebador, 200 nM dNTPs, 2,2 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 0,1% Triton X-100 y 1,2 U Taq polymerasa (Biotools). Se realizaron 20 ciclos de amplificación con un paso de desnaturalización a 94 ºC durante 30 s, de hibridación a 55 ºC durante 25 s, y de extensión a 72 ºC durante 45 s. La segunda etapa consistió en una reamplificación del producto PCR resultante usando las mismas condiciones de amplificación, con excepción de que se realizaron 15 ciclos de amplificación en un volumen final de 40 ml. Como en el caso de la PCR simple se realizaron estudios de sensibilidad en las mismas condiciones que los descritos con anterioridad.
Los resultados obtenidos han permitido, con la metodología descrita, amplificar un fragmento de 166 pares de bases en las biopsias procedentes de embriones machos, mientras que en las muestras procedentes de hembras no se produce amplificación, al carecer las mismas de este locus. Los estudios de sensibilidad a partir de ADN genómico extraído de sangre mostraron un límite mínimo de detección de 20 pg de ADN. En ensayos con diferente número de células procedentes de una biopsia de embriones se encontró que se puede detectar un embrión macho a partir de 5 células. A partir de una cantidad menor de células existe cierta probabilidad de aparición de falsos negativos. Asimismo, para evitar la aparición de falsos negativos y aumentar la sensibilidad de la técnica se realizó la puesta a punto de una PCR doble, de forma que en muestras procedentes de hembras aparece una única banda de 243 pb, mientras que en las muestras procedentes de machos aparecen dos bandas de 166 y 243 pb. Los estudios de sensibilidad a partir de ADN genómico extraído de sangre mostraron un límite mínimo de detección de 0,2 pg de ADN, cantidad inferior al ADN contenido en una célula.
Como conclusión general, los resultados obtenidos en este estudio indican que es posible realizar el sexaje de embriones a partir de una célula, produciendo un daño mínimo al embrión, y en un tiempo de 5 horas, lo que permite mantener los embriones en cultivo y transferirlos frescos, sin necesidad de congelación.
Autoría: J. H. Calvo y colaboradores (2005)
José Luis Ares Cea (recopilación científica)
José Luis Ares Cea (recopilación científica)
