LABORATORIO: CASEÍNA DE LA LECHE-1

Continuando con los métodos oficiales de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación de la caseína de la leche. 

Principios y fundamentos metodológicos.

Se entiende por contenido en caseína de la leche el contenido en proteínas, expresado en porcentaje en peso, obtenidas después de una precipitación a pH 4,6, siguiendo el procedimiento expuesto a continuación, que corresponde a la norma FIL-20: 1964 de la Federación Internaciónal de Lechería (FIL). Este método es aplicable a las leches (no alteradas), natural, certificada, higienizada, esterilizada, y a las reconstituidas (no alteradas posteriormente), de las leches concentrada, evaporada, condensada y en polvo. Asímismo puede aplicarse a las muestras de leche conservadas por adición de formaldehido (1:2500). Se determina la cantidad total de nitrógeno de la leche; a continuación, la caseína se precipita con un tampón acético-acetato y se filtra, determinándose luego la cantidad de nitrógeno del filtrado. La cantidad de caseína se calcula con estas dos determinaciones de nitrógeno, que se realizan empleando el método Kjeldahl (como en el caso de las proteínas ya descrito).

Material y aparatos utilizados.
-Pipetas de 0,5, 1 y 10 ml.
-Probeta graduada de 100 ml.
-Matraz graduado de 100 ml.
-Papel filtro, lavado en ácido, velocidad media: de 11 a 12,5 cm.
-Embudos.

Reactivos necesarios.
-Ácido acético glacial (PA).
-Agua destilada (PA).
-Sodio acetato 1 M.

Se utiliza una solución de ácido acético al 10% (peso/ volumen).

Procedimiento analítico.
1.Preparación de la muestra: Antes del análisis poner la muestra a 20 ± 2,0 ºC y mezclar cuidadosamente. Si no se obtiene una dispersión homogénea de la materia grasa, calentar la muestra lentamente a 40 ºC; mezclar suavemente y enfriar a 20 ±2 ºC.
2.Determinación del parámetro composicional: Determinar el contenido total en nitrógeno (NT) de la leche utilizando el método Kjeldahl, descrito anteriormente para el análisis de las proteínas de la leche.
El precipitado de la caseína se realizará de la siguiente manera: Llevar con pipeta 10 ml de leche a un matraz aforado de 100 ml. Añadir 75 ml de agua destilada (PA) a 40 ºC, y verter después 1 ml de la solución de ácido acético. Mezclar suavemente el contenido del matraz y esperar 10 minutos. Añadir con pipeta 1 ml de la solución de sodio acetato 1M. Mezclar de nuevo. Dejar enfriar el contenido del matraz a unos 20 ºC, completar hasta 10 ml con agua destilada y mezclar invirtiendo lentamente el matraz. Cuando el precipitado de caseína y materia grasa se haya depositado, filtrar con filtro seco y recoger el filtrado en un recipiente seco. Seguidamente, determinar el contenido en nitrógeno de 50 ml de filtrado límpido (nitrógeno no caseínico: NNC), utilizando el método Kjeldahl según la metodología ya descrita.
3.Ensayo en blanco. Además del ensayo en blanco previsto en el método descrito para la determinación de las proteínas de la leche, conviene también hacer un ensayo en blanco para comprobar los reactivos que precipitan la caseína, utilizando para ello 50 ml de agua destilada (PA), 0,5 ml de la solución de ácido acético, y 0,5 ml de la solución sodio acetato 1M.

Expresión de los resultados.
Calcular el porcentaje en peso de NT en la leche y del NNC en el suero límpido, con tres cifras significativas. Corregir la cifra obtenida para NNC por el volumen del precipitado, multiplicando el valor obtenido por 0,994, y calcular la cantidad de caseína mediante la siguiente fórmula:

Cantidad de caseína (en %) = 6,38 x (NT – NNC)

La aplicación de este factor a todas las leches enteras no entraña error sensible; sin embargo, si se aplica el método a la leche desnatada, el factor de corrección utilizado deberá ser 0,998.

La diferencia entre dos determinaciones repetidas no debe sobrepasar el 0,04% de caseína.

Referencias.

-Norma Internacional FIL-IDF 29: 1964.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)

LABORATORIO: PROTEÍNAS DE LA LECHE-1

Continuando con los métodos oficiales de análisis de los productos lácteos, se expone seguidamente la metodología analítica para la determinación de las proteínas de la leche. 

Principios y fundamentos metodológicos.
Las proteínas de la leche se determinan mediante el contenido en nitrógeno expresado en porcentaje en peso, y multiplicado por el factor de conversión, según el método expuesto a continuación, descrito en la norma FIL-20: 1962 de la Federación Internacional de Lechería (FIL). Se trata de un método aplicable, tanto a las leches no alteradas, natural, certificada, higienizada, esterilizada, como a las reconstituidas, procedentes de las leches concentrada, evaporada, condensada y en polvo, asimismo, no alteradas. La determinación del nitrógeno total se realiza por aplicación del método Kjeldahl, que se basa en el tratamiento de una cierta cantidad de leche pesada previamente, utilizando como reactivo el ácido sulfúrico en presencia de mercurio II óxido como catalizador con objeto de transformar el nitrógeno de los compuestos orgánicos en nitrógeno amoniacal. El amoníaco obtenido en el proceso se libera por la adición de sodio hidróxido, se destila, y se recoge a una solución de ácido bórico siendo, a continuación, valorado el amoníaco liberado.

Material y aparatos utilizados.
-Balanza analítica de 1 mg de sensibilidad mínima.
-Aparato de digestión que permita mantener el matraz Kjeldahl en una posición inclinada y provisto de un sistema de calentamiento que no afecte más que a la parte del matraz ocupada por el líquido.
-Matraz Kjeldahl de 500 ml de capacidad.
-Refrigerante Liebig de tubo interior rectilíneo.
-Un tubo de salida con bulbo de seguridad, esférico, y conectado a la parte inferior del refrigerante por unión esmerilada.
-Una alargadera conectada al matraz Kjeldahl y al refrigerante Liebig por medio de goma, y uniones esmeriladas.
-Un matraz erlenmeyer de 500 ml de capacidad.
-Probetas graduadas de 25, 50, 100 y 150 ml.
-Bureta de 50 ml, con escala graduada a 0,1 ml.
-Materiales para facilitar la ebullición: Trozos pequeños de porcelana dura o perlas de vidrio en la etapa de digestión, y en la destilación, se utilizan pequeños trozos de piedra pómez recién calcinados.

Reactivos necesarios.
-Ácido bórico en solución del 4%.
-Ácido clorhídrico 0,1 N.
-Ácido sulfúrico del 96%.
-Agua destilada.
-Azul de metileno.
-Indicador mixto para titulaciones de amoníaco.
-Mercurio II óxido rojo.
-Piedra pómez de 4-8 mm.
-Potasio sulfato.
-Rojo de metilo.
-Sodio tetra-borato 10-hidrato.
-Sodio hidróxido 97% en lentejas.
-Sodio sulfuro 9-hidrato.

El ácido sulfúrico hidróxido se prepara a base de 500 mg de sodio hidróxido del 97% (en lentejas) y 12 g de sodio sulfuro 9-hidrato, disueltos en 1000 ml de agua destilada (PA).
Si no se cuenta con el indicador mixto ya preparado, puede hacerse disolviendo 2 g de rojo de metilo y 1 g de azul de metileno  en 1000 ml de alcohol etílico del 96% (v/v).
La solución de sodio tetra-borato 10-hidrato se utiliza para la valoración del ácido clorhídrico.
Todos los reactivos y las soluciones utilizadas no deben contener sustancias nitrogenadas.

Procedimiento analítico.
1.Preparación de la muestra: Antes del análisis hay que atemperar la muestra a 20 ± 2 ºC, y a continuación se mezcla cuidadosamente hasta conseguir una dispersión homogénea de la materia grasa; en caso contrario, hay que calentarla lentamente a 40 ºC, mezclar suavemente y enfriarla de nuevo a 20 ± 2 ºC.
2.Determinación del parámetro composicional: Introducir y en primer lugar, sucesivamente en el matraz Kjeldahl algunas perlas de vidrio o pequeños trozos de porcelana, y luego añadir unos 10 g de potasio sulfato, 0,5 g de mercurio II óxido rojo, y finalmente, unos 5 g de leche exactamente pesados, con una aproximación de 1 mg. Posteriormente, se añaden 20 ml de ácido sulfúrico del 96% mezclando el contenido del matraz; calentar cuidadosamente el matraz Kjeldhal sobre el dispositivo hasta que no se forme espuma y el contenido se vuelva líquido. Continuar la reacción por calentamiento más intenso, hasta que el contenido del matraz esté perfectamente límpido e incoloro. Durante el calentamiento, agitar varias veces el contenido del matraz, y cuando el líquido esté perfectamente límpido, proseguir la ebullición durante una hora y media, evitando todo sobrecalentamiento local. Dejar enfriar el contenido del matraz a la temperatura ambiente, añadir alrededor de 150 ml de agua destilada, y varios fragmentos de piedra pómez, mezclando cuidadosamente y dejarlo enfriar un poco más de tiempo. Verter, con una probeta graduada en el matraz Kjeldahl, un volumen de 50 ml de la solución de sodio hidróxido conteniendo sulfuro. Durante esta operación, mantener el matraz inclinado, para que el sodio hidróxido se deslice a lo largo de la pared del recipiente evitando que ambos líquidos se mezclen; conectar inmediatamente el matraz Kjeldahl al refrigerante por medio de la alargadera, mezclar el contenido del matraz por agitación, y calentar hasta ebullición evitando la formación de espuma. Proseguir la destilación hasta el momento en que el contenido del matraz presente ebullición en régimen turbulento ('a saltos') y, entonces, regular el calentamiento para que la destilación dure por lo menos 20 minutos. Enfriar bien el destilado para evitar que se caliente la solución de ácido bórico. Poco tiempo antes de terminar la destilación, bajar el matraz erlenmeyer para que el tubo de salida no esté introducido en la solución de ácido bórico. Detener el calentamiento, elevar el tubo de salida y enjuagar sus paredes exteriores e interiores con un poco de agua destilada (PA). A continuación, se valora el destilado utilizando ácido clorhídrico 0,1 N.
3.Ensayo en blanco: Se realiza aplicando el método operatorio ya descrito, pero utilizando cinco mililitros de agua destilada (PA), en lugar de la muestra de leche.

Expresión de los resultados.
1.Nitrógeno total: Se calcula el contenido en nitrógeno total mediante la siguiente fórmula:
Nitrógeno total (en %) = 1,40 N x (V1-V0)/ P
utilizando los factores enumerados a continuación:
N = normalidad del ácido clorhídrico.
V1 = volumen en mililitros de ácido clorhídrico utilizado en la determinación.
V0 = volumen en mililitros de ácido clorhídrico utilizado en el ensayo en blanco.
P = peso en gramos de la leche empleada en el análisis.

La diferencia máxima entre dos determinaciones repetidas no debe sobrepasar el 0,005% de nitrógeno.

2.Proteínas: Para expresar el contenido en proteínas de la leche analizada es preciso multiplicar la cantidad de nitrógeno total, obtenida según el método descrito, por un factor de conversión que se fija en 6,38. En consecuencia, el contenido en proteínas viene dado por la siguiente fórmula:
Proteínas (en %) = 1,40 N x (V1-V0) x 6,38/ P

Referencias.
-Norma Internacional FIL-IDF 20: 1962.
-Métodos Oficiales de Análisis en Alimentaria: Leche y Productos Lácteos. Montplet & Esteban, 1987.

José Luis Ares Cea (coordinador de la Planta Piloto de Lácteos, Consejería de Agricultura y Pesca)