En apartado cuarto del trabajo de investigación sobre caracterización de productos lácteos comerciales reseñado anteriormente en este blog (entrada 23/01/2015) se presentan los resultados de la distribución del nitrógeno en todas las muestras analizadas.
Dentro de los parámetros incluidos en la composición en nitrógeno aparecen las fracciones nitrogenadas: nitrógeno soluble (NS), nitrógeno no proteico (NNP), nitrógeno amínico (NF), y nitrógeno amoniacal (N-NH3); las diferentes caseínas (pre-alfa, alfa, beta, y gamma); y las concentraciones de tirosina (Tyr-NS) y triptófano (Trp-NS) solubles.
La metodología empleada en las fracciones nitrogenadas se ha basado en distintos procedimientos: en el caso de NS y NNP se fraccionaron según el método de Mogensen, y se determinaron sus contenidos mediante el procedimiento de Johnson, mientras que en las fracciones NF y N-NH3, se emplearon las técnicas de Sorensen y Conway (microdifusión), respectivamente.
Las distintas caseínas se determinaron por electroforesis en gel de poliacrilamida, empleándose las técnicas de Ornstein (1964) y Davis (1964) para la separación de éstas y sus primeros productos insolubles de degradación, con geles conteniendo urea 4 M, con un aparato de disco Canalco 1200. Tras disolver una cantidad predeterminada de muestra en 1 ml de urea 8 M, se aplicó a cada columna de gel una alícuota de la fase acuosa clara de 10 microlitros, con un contenido de 200 microgramos de proteína bruta (N x 6,38). Una vez separados los componentes se tiñeron con Negro amido 10 B, eliminándose seguidamente el colorante de fondo de los geles con un decolorador rápido Canalco 1801. Los discos teñidos de las columnas de gel de lavado se cuantificaron en porcentajes relativos, con un densitómetro computador Beckman CDS 200, por grupos pertenecientes a cinco regiones electroforéticas: Pre-alfa-Cn (productos de degradación insolubles de las alfa-caseínas), Alfa-Cn (alfa-caseínas), Beta-Cn (beta-caseínas), Gamma-Cn (gamma-caseínas o productos de degradación insolubles de las beta-caseínas), Origen (caseína inmóvil).
Las concentraciones de tirosina y triptófano solubles se midieron, con un espectrofotómetro Beckman DB-G, las extinciones (E) a 270 y 290 nm, sobre extractos de NS a pH 4,4 ± 0,05, empleando el procedimiento de Vakaleris y Price (1959). La concentración (expresada en moles/ litro de extracto) de la tirosina (Tyr-NS) y el triptófano (Trp-NS) se calculó mediante las siguientes ecuaciones:
Tyr-NS = (0.95 *E270 - 1,31 *E290)/ 1000
Trp-NS = (0,307 *E290 -0,02 *E270)/ 1000
En posteriores entradas de este blog se mostrarán los resultados de la distribución del nitrógeno en el conjunto de muestras analizadas.
Autoría: A. Marcos y colaboradores (1985)
Dentro de los parámetros incluidos en la composición en nitrógeno aparecen las fracciones nitrogenadas: nitrógeno soluble (NS), nitrógeno no proteico (NNP), nitrógeno amínico (NF), y nitrógeno amoniacal (N-NH3); las diferentes caseínas (pre-alfa, alfa, beta, y gamma); y las concentraciones de tirosina (Tyr-NS) y triptófano (Trp-NS) solubles.
La metodología empleada en las fracciones nitrogenadas se ha basado en distintos procedimientos: en el caso de NS y NNP se fraccionaron según el método de Mogensen, y se determinaron sus contenidos mediante el procedimiento de Johnson, mientras que en las fracciones NF y N-NH3, se emplearon las técnicas de Sorensen y Conway (microdifusión), respectivamente.
Las distintas caseínas se determinaron por electroforesis en gel de poliacrilamida, empleándose las técnicas de Ornstein (1964) y Davis (1964) para la separación de éstas y sus primeros productos insolubles de degradación, con geles conteniendo urea 4 M, con un aparato de disco Canalco 1200. Tras disolver una cantidad predeterminada de muestra en 1 ml de urea 8 M, se aplicó a cada columna de gel una alícuota de la fase acuosa clara de 10 microlitros, con un contenido de 200 microgramos de proteína bruta (N x 6,38). Una vez separados los componentes se tiñeron con Negro amido 10 B, eliminándose seguidamente el colorante de fondo de los geles con un decolorador rápido Canalco 1801. Los discos teñidos de las columnas de gel de lavado se cuantificaron en porcentajes relativos, con un densitómetro computador Beckman CDS 200, por grupos pertenecientes a cinco regiones electroforéticas: Pre-alfa-Cn (productos de degradación insolubles de las alfa-caseínas), Alfa-Cn (alfa-caseínas), Beta-Cn (beta-caseínas), Gamma-Cn (gamma-caseínas o productos de degradación insolubles de las beta-caseínas), Origen (caseína inmóvil).
Las concentraciones de tirosina y triptófano solubles se midieron, con un espectrofotómetro Beckman DB-G, las extinciones (E) a 270 y 290 nm, sobre extractos de NS a pH 4,4 ± 0,05, empleando el procedimiento de Vakaleris y Price (1959). La concentración (expresada en moles/ litro de extracto) de la tirosina (Tyr-NS) y el triptófano (Trp-NS) se calculó mediante las siguientes ecuaciones:
Tyr-NS = (0.95 *E270 - 1,31 *E290)/ 1000
Trp-NS = (0,307 *E290 -0,02 *E270)/ 1000
En posteriores entradas de este blog se mostrarán los resultados de la distribución del nitrógeno en el conjunto de muestras analizadas.
Autoría: A. Marcos y colaboradores (1985)
José Luis Ares Cea (recopilación científica)
